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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.5.2015.tde-24112015-084533
Documento
Autor
Nome completo
Filipe Miranda de Oliveira Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2015
Orientador
Banca examinadora
Noronha, Irene de Lourdes (Presidente)
Galvao, Flávio Henrique Ferreira
Abensur, Hugo
Homsi, Eduardo
Título em português
Análise do efeito do Tamoxifeno e da BMP-7 em modelo experimental de fibrose peritoneal em ratos com doença renal crônica
Palavras-chave em português
Fibrose peritoneal
Insuficiência renal crônica
Proteína morfogenética óssea-7
Ratos Wistar
Tamoxifeno
Uremia
Resumo em português
A diálise peritoneal constitui uma importante opção terapêutica para o paciente com doença renal crônica (DRC) em estágio 5. Entretanto, a médio-longo prazo, alterações morfofuncionais relacionadas a vários fatores, como bioincompatibilidade das soluções de diálise e infecções peritoneais, entre outros, estabelecem um processo inflamatório e fibrótico na membrana peritoneal, levando à perda da eficiência deste método dialítico. O estado urêmico destes pacientes é um agravante, pois intensifica o processo inflamatório da membrana peritoneal. Estratégias terapêuticas que desacelerem o processo de fibrose da membrana peritoneal dos pacientes com DRC em diálise são de extrema importância. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo estabelecer um modelo de peritonite fibrosante associado à DRC com uremia, que mimetiza a situação clínica, e analisar, neste modelo, o efeito de duas moléculas antifibróticas, o tamoxifeno (TAM) e a BMP-7 (bonemorphogenic protein-7). A DRC com uremia foi induzida em ratos Wistar através da administração de dieta rica em adenina, por um período de 30 dias. Nos últimos 15 dias, com o estado de uremia já estabelecido, os animais receberam injeções intraperitoneais de gluconato de clorexidina para a indução da fibrose peritoneal (FP). Os tratamentos com tamoxifeno (10mg/Kg/dia, por gavagem) e BMP-7 (30ug/Kg, injeções intraperitoneais a cada 3 dias) foram iniciados junto com a indução da fibrose peritoneal. Foram formados 6 grupos experimentais: CONTROLE, animais normais; DRC, animais com doença renal crônica; FP, animais com fibrose peritoneal; DRC/FP, animais com DRC e FP mimetizando a situação clínica; DRC/FP+TAM, animais com DRC e FP tratados com tamoxifeno; e DRC/FP+BMP7, animais com DRC e FP tratados com BMP-7. Durante os 30 dias de seguimento do estudo foram verificados o peso, a pressão arterial, ureia e creatinina séricas dos animais. Ao término deste período os animais foram sacrificados e o peritônio foi removido e submetido às análises: a) histológica, para avaliar o grau de espessamento (Tricrômio de Masson); b) imunohistoquímica, para localizar e quantificar a presença de células inflamatórias (macrófagos, linfócitos T), miofibroblastos (?-actina) e a atividade de proliferação celular (PCNA); c) análise de citocinas pró-inflamatórias (TNF-alfa, IL-1beta e IL-6) no tecido peritoneal tanto em nível de RNAm, através de PCR em tempo real, como também em nível proteico, através de multiplex; d) PCR em tempo real para determinar a expressão dos componentes da matriz extracelular (colágeno III e fibronectina) e de fatores fibrogênicos (TGF-beta1 e FSP-1). Além disso, com o objetivo de estudar a possível via de sinalização associada à fibrose peritoneal, foi analisada a expressão de SMAD 3 e SMAD 7 no peritônio através de PCR em tempo real e imunohistoquímica para SMAD 3 fosforilada. Por fim, a função peritoneal foi analisada através do teste de ultrafiltração e massa transferida de glicose (MTG). Os dados da evolução ponderal mostraram que, enquanto os animais dos grupos Controle e FP tiveram um ganho de peso significativo em relação ao primeiro dia do protocolo (28% e 18%, respectivamente), os animais dos demais grupos perderam peso significativamente, em média, 26% em relação ao primeiro dia. Todos os animais que receberam dieta rica em adenina e que, portanto, desenvolveram DRC, apresentaram hipertensão arterial, detectada nos dias 15 e 30 do estudo (média de 173mmHg no dia 15 e 172mmHg no dia 30). Confirmando o estabelecimento de DRC com uremia, os animais que receberam dieta rica em adenina apresentaram níveis séricos significativamente elevados de uréia (em média 170 mg/dL no dia 15 e 286 mg/dL no dia 30) e creatinina (média de 0,97 mg/dL no dia 15 e 1,82 mg/dL no dia 30). Os tratamentos com TAM e BMP-7 não influenciaram significativamente nestes parâmetros. A análise da membrana peritoneal dos animais dos grupos experimentais FP e DRC/FP revelou um espessamento significativo da membrana peritoneal (130 ± 33um e 132 ± 26?m, respectivamente vs 36 ± 2um e 27 ±6 um nos grupos CONTROLE e DRC; p < 0,001) bem como a presença de células inflamatórias. Os tratamentos com TAM e BMP7 foram eficazes em proteger a membrana peritoneal contra o espessamento (42 ± 2?m e 53 ± 7?m, respectivamente; p < 0,001 vs DRC/FP) e contra o infiltrado inflamatório. Além disso, no que se refere aos miofibroblastos, células efetoras da fibrogênese detectadas pela marcação de ?-actina, foi encontrado uma marcação significativa de alfa-actina no peritônio dos grupos FP e DRC/FP (p < 0,01 vs CONTROLE), sendo que os tratamentos com TAM e BMP7 protegeram o peritônio da proliferação maciça de miofibroblastos, confirmada pela expressão de PCNA de forma significativa. Com relação à detecção de citocinas pró-inflamatórias, a análise por PCR em tempo real nos animais do grupo DRC mostrou um aumento significativo da expressão no peritônio de TNF-alfa e IL-1beta comparado ao grupo CONTROLE. A expressão dessas citocinas também se mostrou aumentada no peritônio dos animais dos grupos e DRC/FP. Os tratamentos com TAM e BMP7 reduziram a expressão de TNF-alfa e IL-1beta de forma significativa em relação ao grupo DRC/PF (p < 0,01). O reflexo destes resultados pode ser observado com o ensaio por multiplex em que a presença dessas citocinas em sua forma proteica foi encontrada em quantidades significativas no peritônio dos animais com FP e uremia associada à FP em relação ao grupo CONTROLE. Os tratamentos com TAM e BMP7 reduziram a presença dessas citocinas de forma significativa (p < 0,01 vs DRC/FP). Como esperado, a presença de RNAm de componentes da matriz extracelular foi significativamente maior nos grupos FP e DRC/FP, comparados ao grupo CONTROLE. De fato, a expressão de colágeno III foi maior nos grupos FP e DRC/FP (3,4 ± 1 e 10,3 ± 2,4 UI, respectivamente; p < 0,01 vs CONTROLE), bem como de fibronectina nos grupos (6,5 ± 0,8 e 29,2 ± 1 UI, respectivamente; p < 0,01 vs CONTROLE). Os animais tratados com TAM e BMP7 apresentaram uma diminuição significativa tanto da expressão de colágeno III (1,5±0,9 e 0,2±0,1 UI, respectivamente; p < 0,01 vs DRC/FP), como da expressão de fibronectina (6,6±1,2 e 9,7±0,5 UI, respectivamente; p < 0,01 vs DRC/FP), confirmando um efeito anti-fibrótico dessas drogas. Ainda, enquanto nos grupos FP e DRC/FP a expressão de TGF-? foi significativamente maior em relação ao grupo CONTROLE (13,2±0,9 e 30,3±0,1 UI, respectivamente; p < 0,01), TAM e BMP7 diminuíram a expressão de TGF-beta (17,7±0,2 e 16,2±0,1 UI, respectivamente; p < 0,01 vs DRC/FP). Padrão similar foi encontrado com a expressão do RNAm para FSP-1 em que houve um aumento significativo da expressão desse gene nos grupos FP e DRC/FP, com significativo bloqueio nos animais tratados com TAM e BMP7 (p < 0,01 vs DRC/FP). Com relação à análise das vias de sinalização possivelmente envolvidas no processo, a expressão de SMAD 3 foi significativamente maior nos grupos FP e DRC/FP (3,7±0,3 e 4,6±0,3 UI, respectivamente) em relação aos grupos CONTROLE e DRC (1±0,2 e 1,3±0,6 UI, respectivamente; p < 0,01). Os tratamentos com TAM e BMP7 diminuíram a expressão da SMAD 3 no peritônio (1,1±0,6 e 1,1±0,7 UI, respectivamente; p < 0,01 vs DRC/FP). Contudo TAM e BMP7 aumentaram significativamente a expressão de SMAD 7 (2,8±0,5 e 3,7±0,5 UI, respectivamente; p < 0,01 vs DRC/FP), uma proteína contra reguladora da via do TGF-beta, capaz de bloquear a expressão de fatores pró-fibróticos bem como de fatores inflamatórios. Finalmente, os grupos tratados TAM e BMP7 tiveram a função do peritônio preservada quando comparados aos grupos FP e DRC/FP, verificado pela manutenção da capacidade de ultrafiltração e de reduzir a MTG. Em resumo, tamoxifeno e BMP7 foram capazes de bloquear o espessamento da membrana peritoneal, proteger o peritônio contra a infiltração de células inflamatórias e de miofibroblastos, além de diminuir a proliferação celular no peritônio. Estes tratamentos também foram eficazes em diminuir significativamente a expressão dos fatores pró-fibróticos e das citocinas inflamatórias. Com relação às SMADs, os tratamentos com TAM e BMP7 foram eficazes em bloquear a expressão de SMAD 3, bem como aumentar a expressão de SMAD 7. Os resultados do presente estudo sugerem que tamoxifeno e BMP7 protegem o peritônio no modelo de fibrose peritoneal desenvolvido em ratos com DRC e uremia, possivelmente devido aos seus efeitos anti-inflamatórios e anti-fibróticos
Título em inglês
Analysis of the effect of tamoxifen and BMP-7 in an experimental model of peritoneal fibrosis in rats with chronic kidney disease
Palavras-chave em inglês
Bone morphogenic protein 7 (BMP-7)
Chronic kidney disease
Peritoneal fibrosis
Tamoxifen
Uremia
Wistar rats
Resumo em inglês
Peritoneal dialysis is an important therapeutic option for patients with stage 5 chronic kidney disease (CKD). However, at medium and long term, morphological and functional changes related to various factors such as bioincompatibility of dialysis solutions and peritoneal infections, among others, establish an inflammatory and fibrotic process in the peritoneal membrane, leading to a loss of dialysis efficiency. The uremic state of these patients aggravates this situation because it intensifies inflammation of the peritoneal membrane. Therapeutic strategies that slow the process of fibrosis of the peritoneal membrane of patients with CKD on dialysis are extremely important. In this context, the present study aimed to establish a model of peritoneal fibrosis associated with CKD with uremia, that mimics the clinical situation, and analyze the effect of two antifibrotic molecules, tamoxifen (TAM) and the BMP7 (bone morphogenic protein-7), in the proposed model. CKD with uremia was induced in male Wistar rats by adenine in the diet during a period of 30 days. After 15 days, with the state of uremia already established, animals received intraperitoneal injections of chlorhexidine gluconate, for the induction of peritoneal fibrosis (PF). Treatment with TAM (10mg/Kg/day by gavage) and BMP7 (30ug/Kg, intraperitoneal injections every 3 days) were initiated along with the induction of peritoneal fibrosis. Six groups were induced: CONTROL, normal animals; CKD, animals with chronic kidney disease; PF, animals with peritoneal fibrosis; CKD / PF, animals with CKD and PF mimicking the clinical situation; CKD / PF + TAM, animals with CKD and PF treated with tamoxifen; and CKD / PF + BMP7, animals with CKD and PF treated with BMP7. During 30 days of the follow-up study, weight, blood pressure, serum urea and creatinine of the animals were verified. At the end of this period, the animals were sacrificed and the peritoneum was removed and subjected to the following analysis: a) histology, to assess the degree of thickening (Masson's Trichrome); b) immunohistochemistry, to locate and quantify the presence of inflammatory cells (macrophages, T lymphocytes), myofibroblasts (alfa-smoth muscle actin) and cell proliferation activity (PCNA); c) analysis of pro-inflammatory cytokines (TNF-alfa, IL-1beta and IL-6) both in peritoneal tissue mRNA level through real time PCR as well as on protein level by multiplex; d) real-time PCR to determine the expression of extracellular matrix components (collagen III and fibronectin) and fibrogenic factors (TGF-beta and FSP-1). Furthermore, in order to study the possible signaling pathway associated to peritoneal fibrosis, the expression of SMAD 3 and SMAD 7 in the peritoneum was analyzed via real-time PCR and immunohistochemistry for phosphorylated SMAD 3. Finally, the peritoneal function was assessed by ultrafiltration and mass transferred glucose test (MTG). Data from weight gain showed that while animals from CONTROL and PF groups had significant weight gain (28% and 18% respectively) compared to the first day of protocol, the animals of other groups lost weight significantly, on average, 26% compared to the first day. All animals that received diet rich in adenine developed CKD presented by hypertension, detected on days 15 and 30 of the study (average of 173mmHg and 172mmHg respectively). Confirming the establishment of CKD with uremia, the animals that received diet rich in adenine showed serum urea (average 170 mg/dL on day 15 and 286 mg/dL on day 30) and creatinine (average of 0.97 mg/dL on day 15 and 1.82 mg/dL on day 30) significantly higher in the 15th and 30th days. Treatments with TAM and BMP7 did not influence these parameters. The peritoneal membrane analysis of PF and CKD/PF experimental groups showed a significant thickening of the peritoneal membrane (130 ± 33?m and 132 ± 26?m, respectively; p < 0.001 vs 36 ± 2um and 27 ± 6?m in CONTROL and CKD; p < 0.001) with presence of inflammatory cells. The treatments with TAM and BMP7 were effective in protecting the membrane against the thickening (42 ± 2um and 53±7um, respectively; p < 0.001 vs CKD/PF) and inflammatory infiltrate. Furthermore, with regard to myofibroblasts, effectors cells in the fibrogenesis process detected by alfa-SMA presence, it was found a signicantly expression in the peritoneum of PF and CKD/PF (p < 0.01 vs CONTROLE), and the treatment with TAM and BMP7 significantly protected against the presence of myofibroblasts confirmed by the significantly expression of PCNA. With regard to the detection of pro-inflammatory cytokines, analysis by real-time PCR in the animals of CKD group showed a significant increase in TNF-alfa expression in the peritoneum and IL-1beta compared to the CONTROL group. The expression of these cytokines was also increased in the peritoneum of the CKD/PF group. The treatment with TAM and BMP7 significantly reduced TNF-alfa and IL-1beta expression compared to CKD/PF group (p < 0.01).The repercussion of these results can be observed with the multiplex test in which the presence of these cytokines in its protein form were found in significant quantities in the peritoneum of the animals with uremia associated with PF compared to CONTROL group. The treatment with TAM and BMP7 significantly reduced the presence of these cytokines (p < 0.01 vs CKD/PF). As expected, the mRNA expression of extracellular matrix components was significantly elevated in the PF group and CKD/PF compared to the control group. Indeed, collagen III mRNA expression was higher in PF and CKD/PF group (3.4 ± 1 and 10.3 ± 2.4 UI, respectively; p < 0.01 vs CONTROL) as well as fibronectin (6.5 ± 0.8 and 29.2 ± 1 UI; respectively; p < 0.01 vs CONTROL). The animals treated with TAM and BMP7 significantly blocked the expression of collagen III (1.5 ± 0.9 and 0.2 ± 0.1 UI, respectively; p < 0.01 vs CKD/PF) and fibronectin (6.6±1.2 and 9.7±0.5 UI, respectively; p < 0.01 vs CKD/PF). Further, while in the PF and CKD/PF groups the expression of TGF-beta (13.2 ± 0.9 UI and 30.3 ± 0.1 UI, respectively; p < 0.01) was significantly higher compared to the CONTROL group, TAM and BMP7 decreased the expression of TGF-beta (17.7 ± 0.2 UI and 16.2 ± 0.1UI, respectively; p < 0.01 vs CKD/PF). A similar trend was found with the expression of FSP-1 mRNA with an increase in expression of this gene in PF and CKD/PF groups (p < 0.01 vs CONTROL), with significant blockage in the animals treated with TAM and BMP7 (p < 0.01 vs CKD/PF). Regarding the analysis of signaling pathways possibly involved in the process, SMAD 3 expression was significantly higher in PF and CKD/PF groups (3.7 ± 0.3 UI and 4.6 ± 0.3 UI, respectively) compared to groups CONTROL and CKD (1 ± 0.2 UI and 1.3 ± 0.6 UI, respectively; p < 0,01). Treatments with TAM and BMP7 decreased the expression of SMAD 3 in the peritoneum (1.1 ± 0.6 UI and 1.1 ± 0.7 UI, respectively; p < 0.01 vs CKD/PF). Yet TAM and BMP7 significantly increased the expression of SMAD 7 (2.8 ± 0.5 and 3.7 ± 0.5, respectively; p < 0.01 vs CKD/PF), a regulatory TGF-beta protein capable of blocking the expression of pro-fibrotic and inflammatory factors. Finally, the treated groups had the function of the peritoneum preserved when compared to the PF and CKD / PF groups, checked through the maintenance of the ultrafiltration capacity and reducing MTG. In summary, the animals treated with TAM and BMP7 had the peritoneum protected from thickening, inflammatory infiltrate, presence of myofibroblasts and cellular proliferation. The treatments were also effective in significantly reduce the expression of pro-fibrotic factors and inflammatory cytokines. Regarding SMADs, treatments with TAM and BMP7 were effective in blocking the expression of SMAD 3 and increase SMAD 7 expression. The results of this study suggest that tamoxifen and BMP7 protected the peritoneum in an experimental model of peritoneal fibrosis developed in uremic rats with CKD, possibly due to their anti-inflammatory and anti-fibrotic properties
 
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Data de Publicação
2015-11-24
 
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