O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um teste não invasivo para a trissomia do cromossomo 21 através da análise de ácidos nucleicos fetais livres no plasma materno por sequenciamento de última geração realizado no sequenciador automático Ion Torrent. A metodologia proposta para o teste é a análise de SNPs com alta taxa de heterozigosidade na população brasileira localizados em dois genes presentes no cromossomo 21 (PLAC4 e C21orf105), e a detecção da cópia extra do cromossomo 21 é feita pela razão dos alelos desses SNPs, sendo que a razão de 1:1 indica que o feto é normal, e a razão de 2:1 indica que o feto tem uma cópia extra do cromossomo 21. Para a validação da metodologia foram utilizadas 50 amostras de DNA livre extraídas de líquido amniótico, previamente caracterizadas por análise citogenética consideradas como o padrão ouro pois contém apenas material genético fetal abundante. A metodologia foi validada com sucesso nessas amostras, sendo que as 24 amostras de fetos com trissomia foram claramente distinguidas das 26 amostras de fetos normais. A metodologia validada foi aplicada a 44 amostras de DNA livre extraídas de plasma de gestantes (21 amostras de fetos com trissomia do 21 e 23 de fetos normais), porém não foi possível fazer a distinção entre fetos normais e fetos com trissomia do 21, possivelmente devido à variações na fração fetal do DNA livre em relação à fração materna. Como nosso objetivo principal não foi alcançado, Propomos aqui que o teste realizado em líquido amniótico seja utilizado como uma alternativa mais simples, rápida e barata ao cariótipo convencional atualmente utilizado para fazer o diagnóstico da trissomia do cromossomo 21 em amostras coletadas por procedimentos invasivos, enquanto as deficiências do teste não-invasivo pelo plasma materno são aprimoradas

The purpose of this study was to develop a test for trisomy 21 by analyzing cell-free fetal nucleic acids in maternal plasma by next-generation sequencing performed on automated sequencer Ion Torrent. The proposed methodology for the test is based on analysis of SNPs with high heterozygosity rates in Brazilian population, located in two genes present on chromosome 21 (PLAC4 and C21orf105), and the detection of the extra copy of chromosome 21 is made by the allelic-ratio of these SNPs, where 1:1 ratio indicates a normal fetus, and the 2:1 ratio indicates that the fetus has an extra copy of chromosome 21. In order to validate the methodology 50 cell-free DNAs extracted from amniotic fluid were used representing a gold standard since it contains abundant genetic material exclusively from the fetus. The methodology has been successfully validated in these samples, all the 24 samples from fetuses with trisomy 21 were clearly distinguished from 26 samples of normal fetuses. The validated method was applied to 44 cell-free DNA samples extracted from plasma of pregnant women (21 samples from fetuses with trisomy 21 and 23 from normal fetuses), but unfortunately it was not possible to distinguish between normal and trisomy 21 fetuses, possibly due to variations on the fetal fraction of the cell-free DNA in relation to maternal fraction. As our main goal was not achieved, we propose here that the test performed on amniotic fluid sample could be used as a simpler, faster and cheaper alternative test to traditional karyotype, which is used nowadays to make the diagnosis of trisomy 21 in samples collected by invasive procedures. In parallel, minor improvements in the described method may enable its clinical use