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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.46.2008.tde-27112008-094236
Documento
Autor
Nome completo
Cerize da Silva Santos
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2008
Orientador
Banca examinadora
Baader, Josef Wilhelm (Presidente)
Baptista, Mauricio da Silva
Torres, Yohandra Reyes
Título em português
Oxidação quimiluminescente do luminol em meios micelares: desenvolvimento de uma ensaio para determinação da capacidade anti-radicalar
Palavras-chave em português
Antioxidantes
Bioluminescência
Ensaio anti-radicalar
Luminol
Micela
Oxidação
Química orgânica
Quimiluminescência
Solução aquosas
Tensoativo
Resumo em português
Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia para a determinação da capacidade anti-radicalar de substâncias hidrofílicas e lipofílicas baseada na quimiluminescência do luminol em meio micelar. A reação de luminol, hemina e peróxido de hidrogênio foi estudada na presença de tensoativos carregados (CTAB/CTAC e SDS). Variou-se independentemente a concentração de cada reagente de forma a avaliar seu papel sobre a intensidade inicial de emissão (I0), que é proporcional à velocidade inicial da reação. Em solução aquosa de SDS, a I0 apresentou correlação linear com a concentração de H2O2 entre 5,0 10-6 e 6,0 10-5 mol/L e com a concentração de hemina no intervalo de 8,0 10-9 a 4,0 10-7 mol/L. O aumento da concentração de luminol no intervalo de 5,0 10-7 a 1,0 10-3 provocou aumento na I0 até 5,0 10-5 mol/L, permanecendo constante para concentrações maiores. Na presença de CTAB, o valor de I0 variou linearmente com a concentração de H2O2 no intervalo estudado (2,0 10-5 a 6,7 10-4 mol/L). A I0 aumentou com o aumento da concentração da hemina entre 8,0 10-8 e 8,0 10-6 mol/L. A variação da concentração de luminol de 5,0 10-7 a 5,0 10-5 também provocou aumento na I0, a qual ficou constante para concentrações maiores. Para este tensoativo foram realizadas também medidas de cmc nas condições de reação (tampão fosfato pH 11,6 e µ = 0,1), obtendo-se um valor de 2 10-4 mol/L, cinco vezes menor do que a cmc em água. As mudanças espectrais de hemina e luminol em diferentes concentrações de CTAB foram avaliadas, obtendo-se evidências da interação destes reagentes com o tensoativo. Destes estudos, foi possível compreender melhor o comportamento do sistema e foram encontradas condições nas quais se obtêm decaimento lento da intensidade de emissão e I0 alto. Estas condições são ideais para a realização de um ensaio de determinação da capacidade anti-radicalar. O efeito do antioxidante trolox, utilizado como padrão, foi avaliado nestas condições nos sistemas baseados nos três tensoativos. Em todos os casos, observou-se correlação linear entre a concentração de trolox e a área suprimida na cinética de emissão, a qual é proporcional ao número de radicais seqüestrados pelo antioxidante. Os limites de detecção para trolox ficaram abaixo de 1,0 10-7 mol/L, e a faixa de linearidade é de no mínimo uma ordem de grandeza (não foram testadas concentrações superiores a 2,0 10-6 mol/L). No meio de reação com CTAB foram determinadas as capacidades anti-radicalares (n) dos seguintes antioxidantes: vitamina E (n=3,5 ± 0,1), rutina (n=4,0 ± 0,2), quercetina (n=3,8 ± 0,4) e ácido úrico (n=1,3 ± 0,1). Os valores de n determinados com este método foram muito similares com aqueles medidos utilizando-se o ensaio com o radical estável DPPH. Portanto, o ensaio desenvolvido com luminol em meio micelar se mostrou adequado para testar tanto substâncias hidrossolúveis como lipossolúveis. Foram testadas condições para a realização de ensaios consecutivos com injeções repetidas de várias alíquotas de antioxidante na presença de CTAB. Os valores encontrados com o ensaio realizado desta forma foram iguais aos obtidos com o ensaio onde as injeções são feitas individualmente. Este método permite automação e resulta na economia de reagentes e redução do tempo de ensaio
Título em inglês
Chemiluminescent oxidation of luminol in micellar media: development of an anti-radical capacity assay
Palavras-chave em inglês
Antioxidants
Antiradical assay
Chemiluminescence
Luminol
Micelle
Organic chemistry
Surfactant
Resumo em inglês
In this work, a methodology to evaluate the anti-radical capacity of hydrophilic and lipophilic compounds based on luminol chemiluminescence in micellar media was developed. The reaction of luminol, hemin and hydrogen peroxide was studied in the presence of charged surfactants (CTAB/CTAC and SDS). The concentration of each reagent was independently varied in order to evaluate its influence on the initial emission intensity (I0), which is proportional to the initial reaction rate. In aqueous SDS solution, I0 showed a linear correlation with the H2O2 concentration between 5,0 10-6 and 6,0 10-5 mol/L, and with the hemin concentration between 8,0 10-9 and 4,0 10-7 mol/L. An increase in the luminol concentration between 5,0 10-7 and 1,0 10-3 mol/L led to an increase in I0 up to 5,0 10-5 mol/L, higher luminol concentrations do not further increased I0. In the presence of CTAB, I0 increased linearly with the H2O2 concentration in the interval studied (2,0 10-5 to 6,7 10-4 mol/L). An increase in I0 was also observed on increasing the hemin concentration from 8,0 10-8 to 8,0 10-6 mol/L. An increase of the luminol concentration from 5,0 10-7 to 5,0 10-5 increased the observed I0, which did not change for higher luminol concentrations. The cmc of CTAB was measured in the reaction conditions (phosphate buffer pH 11,6 and µ= 0,1), and the value determined, 2 10-4 mol/L, was five times lower than the cmc in water. The absorption spectra of hemin and luminol in different CTAB concentrations showed significant variation with the surfactant concentration, indicating an interaction between these reagents and the surfactant. With these studies it was possible to understand well the behavior of the system and to establish experimental conditions which lead to kinetic curves with a slow emission intensity decay and relatively high I0, ideal conditions for the performance of the anti-radical capacity assay. The effect of trolox, the antioxidant used as reference, was evaluated in this conditions in the systems based on the three surfactants. In all the cases a linear correlation between the trolox concentration and the suppressed area in the emission kinetics was observed. This area is proportional to the number of radicals trapped by the antioxidant. Detection limits for trolox were below 1,0 10-7 mol/L, and the linear range was at least one order of magnitude (concentrations higher than 2,0 10-6 mol/L were not evaluated). The antioxidant capacity (n) was determined in the reaction medium containing CTAB for vitamin E (n= 3,5 ± 0,1), rutin (n=4,0 ± 0,2), quercetin (n=3,8 ± 0,4) and uric acid (n=1,3 ± 0,1). The n values determined by this method were very similar to those measured with the DPPH assay. Hence, the assay developed with luminol in micelar media was adequate to evaluate the anti-radical capacity of hidrosoluble as well as liposoluble compounds. The assay conditions established in the presence of CTAB allowed the consecutive injection of antioxidant samples during the same kinetic run. The values determined in this consecutive injection assay proved to be very similar to those obtained in the assay where injections were made individually. This method allows automation, economy of reagents and reduction of assay time
 
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Data de Publicação
2009-02-03
 
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