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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.46.2007.tde-02072008-160723
Documento
Autor
Nome completo
Adjaci Uchoa Fernandes
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2007
Orientador
Banca examinadora
Baptista, Maurício da Silva (Presidente)
Itri, Rosangela
Kato, Massuo Jorge
Medeiros, Marisa Helena Gennari de
Serra, Osvaldo Antonio
Título em português
Síntese, caracterização e fotoatividade de fotossensibilizadores derivados de protoporfirina IX e de clorofilina
Palavras-chave em português
Células HeLa
Membrana
Mitocôndrias
PDT
Porfirinas
Terapia Fotodinâmica
Resumo em português
Processos que envolvem sensibilização são extremamente importantes para diversas áreas do conhecimento, incluindo a biologia, a química e a medicina. A aplicação de sensibilização em medicina tem se destacado, especialmente, em face de uma modalidade alternativa de tratamento de câncer denominada terapia fotodinâmica (TFD). Uma das linhas de pesquisas fundamentais para a evolução da terapia fotodinâmica é o desenvolvimento de novos fotossensibilizadores (Fs) com composição definida, que absorvam na janela terapêutica (600- 800nm) e que apresentem maior eficiência na indução de apoptose. Os Fs que apresentam cargas positivas e que são relativamente lipofílicos, permeiam membranas e são atraídos pelo potencial negativo das mitocôndrias, que tem papel central no controle da vida e da morte celular. Neste trabalho foi realizado um estudo da influência dos grupos funcionais na atividade dos Fs, através da funcionalização da protoporfirina IX (Pp IX). Foram estudadas três diferentes rotas sintéticas. Na rota I (esquema 14), utilizou-se como composto de partida a Hematoporfina IX (Hp IX), a qual foi funcionalizada com grupos aminas e amidas, respectivamente, nas hidroxilas e nas carboxilas. Esta rota forneceu baixo rendimento global (20%), e compostos de difícil purificação, no entanto obteve-se 1 composto puro. Na rota II (esquema 15), utilizou-se como composto de partida a Pp IX, a qual foi funcionalizada nos grupos vinílicos com grupos aminas. Obteve-se 4 compostos, com rendimento global de reação superior a 50%, mas observou-se que ocorre uma reação de eliminação que impede a quartenarização das aminas localizadas nas posições α ao anel porfirínico. Na rota III (esquema 16), os grupos carboxílicos de Pp IX foram transformados em cloreto de ácido, que foram substituídos por compostos bifuncionais, amina primária e um segundo grupo. Esta rota possibilitou a obtenção de 7 compostos, inclusive compostos quaternários com rendimento global de reação superior a 70%. Dois derivados da clorofilina, que apresentam a banda QIV com um ε elevado em 650nm, foram também sintetizados. Todos os compostos, foram caracterizados estruturalmente de forma inequívoca através do espectro eletrônico (UV-vis e fluorescência), vibracional no infravermelho, RMN de 1H e 13C (1D e 2D) e espectrometria de massa. A série de compostos obtidos permitiu um estudo da relação entre a estrutura química do Fs com a sua fotoatividade. As propriedades fotofísicas foram caracterizadas por espectro de absorção e de emissão, fotólise de relâmpago a laser, eficiência quântica de fluorescência e de geração de oxigênio singlete. Estas determinações indicaram que as propriedades fotofísicas dos Fs não foram consideravelmente alteradas no processo sintético. Foi determinada a formação de agregados em solução aquosa e o equilíbrio monômero agregado foi deslocado no sentido da formação do monômero na presença de micelas de CTAB e SDS e de soro fetal. Observou-se, que a contribuição para desagregação é mais eficiente quando a carga da micela é oposta à do Fs. Foi determinado o coeficiente de partição octanol/água (logPo/a) em função do pH e constatou-se que os compostos que têm carga líquida apresentam valores de logPo/a entre -1 e 1 na faixa de pH entre 3 e 10. A incorporação destes compostos em lipossomos, seguiu perfil esperado considerando a carga, o logPo/a e a característica anfifílica dos compostos sintetizadas. Genericamente a eficiência de morte celular fotoinduzida seguiu o perfil de incorporação das drogas em células HeLa. Os estudos comparativos da citolocalização foram realizados por co-encubação das porfirinas sintetizadas com rodamina 123 (Rd), que se concentra em mitocôndrias. A localização em organelas citoplasmáticas foi determinada através de imagens obtidas por microscopia de fluorescência confocal. A sobreposição da emissão da Rd foi de 80% e 31% com o composto catiônico PpNpNI e aniônico PpNetPO3, respectivamente, comprovando a localização mitocondrial do composto positivo.
Título em inglês
Synthesis, characterization and photoactivity of photosensitizers derivatived from protoporphyrin IX and chlorophyllin
Palavras-chave em inglês
HeLa Cells
Membrane
Mitochondrias
PDT
Porphyrin
Resumo em inglês
Processes that involve sensitization are extremely important for several areas of knowledge, including biology, chemistry and medicine. The application of sensitization in medicine is especially important, in face of an alternative modality of cancer treatment called Photodynamic Therapy (PDT). One of the lines of basic research important for the evolution of PDT is the development of new photosensitizers (PS) with defined composition, that absorb in the therapeutical window (600-800nm) and that present greater efficiency in the induction of apoptosis. Positively charged PS with the proper lipophilic/hidrophilic balance permeate membranes and are attracted by the negative potential of mitochondria, which is an organelle that has central roles in the control of cell life and death. In this work the influence of the functional groups in the activity of PS was carried out, through the functionalization of protoporphyrin IX (Pp IX). Three different synthetic routes were used. In route I (scheme 14), Hematoporphyrin IX (Hp IX), was used as departure compound and it was modified with amino and amide groups in hydroxyls and carboxyls, respectively. We found low yield in the synthetic (20%) and purification steps. However 1 pure PS was obtained. In route II (scheme 15), Pp IX was used as departure compound, which was modified in the vinilic groups with amino groups. We obtained 4 compounds, with global yield superior than 50%, but it was observed that an elimination reaction occurs that hinders the quarternization of the amino groups located in position α to the porphyrin ring. Into route III (scheme 16), the carboxilic groups of Pp IX had been transformed into chloride acid, which was substituted by bi- functional groups, primary amine in one side and another group in the other. This route made it possible to obtain 7 compounds, including quaternary ammonium compounds with global yield superior than 70%. Two derivatives of chlorophyllin, that present QIV band with large extinction coefficient in 650nm, also were synthesized. All compounds were characterized structurally through the electronic and vibrational spectra (UV-vis and fluorescence, IR), RMN of 1H and 13C (1D and 2D) and mass spectrometry. This series of compounds allowed us to study the relation between the chemical structure of the Fs with its photoactivity. The photophysical properties were characterized by emission and absorption spectra, laser flash photolysis, fluorescence emission in the visible and NIR regions (generation of singlet oxygen). These determinations indicated that the photophysical properties of the PS were not modified in the synthetic process. The formation of aggregates were characterized in aqueous solution and the balance between aggregate and monomer species was dislocated in the direction of the formation of monomers in the presence of CTAB, SDS micelles and fetal serum. It was observed, that the disaggregating efficient is larger with micelles that have the opposite charges to that of the PS. The Octanol water partition coefficient (logPo/a), was determined as a function of pH. logPo/a values between -1 and 1 were observed for charged PS in the pH range of 3-10. The incorporation of these compounds in liposomes, followed the expected profile considering the charge, logPo/a and the amphifilic nature. Generically, the photoinduced cell death efficiency followed the profile of incorporation of the PS in HeLa cells. Comparative studies of cytolocalization were carried out by co-incubation of the cells with porphyrins and Rhodamine 123 (Rd), which localizes in mitochondria. The localization in cytoplasmic organelles was determined through fluorescence confocal microscopy images. The overlapping emission of the Rd was of 80% and 31% with the cationic PpNpNI and the anionic PpNetPO3 compounds, respectively, proving the mitochondrial localization of the positive PS.
 
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Data de Publicação
2008-09-25
 
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