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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.46.2019.tde-31012019-101046
Document
Author
Full name
Patricia de Fátima Lopes
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2001
Supervisor
Committee
Colepicolo, Pio (President)
Cuccovia, Iolanda Midea
Plastino, Estela Maria
Sluys, Marie Anne van
Terra, Clelia Ferreira
Title in Portuguese
Caracterização bioquímica e regulação da nitrato redutase na macroalga marinha Gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta)
Keywords in Portuguese
Bioquímica
Enzimas (Metabolismo)
Enzimologia
Nitrato redutase
Proteínas (Metabolismo)
Purificação
Abstract in Portuguese
A alga marinha Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia (Gracilariales, Rhodophyta) tem grande importância econômica por ser a principal fonte para a produção de ficocolóides. Esta linhagem tem sido extensivamente cultivada em tanques ou diretamente no mar na China e Taiwan por exibir grande tolerância a variação de fatores ambientais. A maior fonte de nitrogênio no oceano está na forma de nitrato que é o principal fator limitante no crescimento das macroalgas. A assimilação de nitrogênio é um processo que ocorre em duas etapas catalisadas sequencialmente pelas enzimas nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR), respectivamente. A NR catalisa a redução de nitrato a nitrito usando NAD(P)H como fonte doadora de elétrons. O nitrito é reduzido a amônio (pela NiR) e é imediatamente assimilado em compostos orgânicos nitrogenados, como aminoácidos e bases nitrogenadas. A NR é considerada o primeiro passo regulador no processo de assimilação de nitrato. Neste trabalho descrevemos a oscilação circadiana da atividade da NR bem como do seu conteúdo protéico em G. tenuistipitata. A atividade da NR e os níveis da proteína NR apresentam um pico no meio do dia em algas mantidas sob regime de claro:escuro (12:12h). A atividade de NR é 30 vezes maior durante o período de claro em algas crescendo sob condições de luz:escuro, e o nível protéico de NR é cerca de 40 vezes maior em extratos do período de claro. A oscilação observada está sob controle do relógio biológico uma vez que a flutuação da atividade da NR persiste após 10 dias sob condições de claro constante. Nenhuma oscilação na atividade de NR foi encontrada quando a alga foi mantida sob escuro constante, demonstrando que a luz é um fator de grande importância no controle desta enzima. Experimentos de absorção de nitrato do meio realizados em culturas de algas crescendo sob condições de claro:escuro mostrou que a absorção de nitrato ocorre preferencialmente no período noturno, ocorrendo o pico máximo de absorção no meio da noite. Daí concluirmos que os processos de assimilação de nitrato e tomada do mesmo do meio estejam ocorrendo de maneira independente. A NR de G. tenuistipitata pertence a classe das NRs específicas para o NADH, com constante de Michaelis-Menten aparente de 95 µM. O KM aparente para o nitrato foi estimado em 197 µM, valor esse razoável com os descritos para outras algas. A focalização isoelétrica revelou que a NR é uma proteína básica com pI de 8,66. A NR desta espécie foi purificada em 4 etapas: cromatografia de troca iônica, precipitação com sulfato de amônio, filtração em gel e cromatografia de afinidade em resina Affigel-blue. A proteína não desnaturada apresenta massa molecular de aproximadamente 420 kDa, e 4 subunidades idênticas de 110 kDa, baseado em SDS-PAGE. A localização intracelular da NR de G. tenuistipitata foi examinada utilizando técnicas de imunofluorescência e "immuno-gold" e revelaram que a NR está associada com os cloroplastos.
Title in English
Biochemical characterization and regulation of nitrate reductase in the marine macro-stage Gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta)
Keywords in English
Biochemistry
Enzymes (Metabolism)
Enzymology
Nitrate reductase
Proteins (Metabolism)
Purification
Abstract in English
The marine red alga Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia) is economically important, being the main source for the production of phycocolloids. This strain is extensively cultivated in ponds in southern China and Taiwan and exhibits a wide tolerance to environmental factors. The major source of nitrogen in the ocean is in the form of nitrate being the main limiting macroalgal production. The nitrogen assimilation process occurs in a two-step reaction catalyzed by 2 enzymes working sequentially, nitrate reductase (NR) and nitrite reductase (NiR). NR catalyzes the reduction of nitrate to nitrite using NAD(P)H as electron donor. Nitrite is reduced to ammonium (by NiR) and it is immediately assimilated in organic nitrogen compounds, such as amino acids and bases. NR is considered the first and regulatory step in this assimilating process. We report the circadian oscillation of NR activity as well as NR protein content in G. tenuistipitata. Both NR activity and NR protein levels peaks at midday in algae maintained under light:dark cycle (12:12h). Toe NR activity is 30 fold higher in light period for alga growing under light-dark conditions, and the NR protein level is about 40 fold higher in extracts from the light period. The oscillation observed is under biological clock control since the fluctuation of NR activity persists after 10 days under constant light conditions. No oscillation in the NR activity is found when the algae were maintained under constant dark condition. The experiments on nitrate uptake carried out in algae growing under light:dark conditions had shown that the absorption peaks at the middle of the dark periods. So we can conclude that the process of nitrate assimilation and nitrate uptake is occurring in such an independent ways. NR from G. tenuistipitata is a NADH specific enzyme with Michaelis-Menten apparent constant of 95 µM. Toe apparent KM for nitrate was estimated to be 197 µM, which is reasonable with the values described to another algae. The isoeletric focusing revealed NR is a basic protein with pi of 8.66. The NR from was purified in four steps: ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, and Affigel-blue affinity column. Non-denaturated protein shows a molecular mass of about 420 kDa, and 4 identical subunits of 110 kDa, based on SDS-PAGE. Toe intracellular localization of NR in G. tenuistipitata was examined by applying both immunofluorescence and immunogold methods revealing NR associated with chloroplasts.
 
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Publishing Date
2019-01-31
 
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