Domínios são definidos como unidades de dobramento independente e estáveis que formam a estrutura das proteínas (Richardson, 1981; Dootlitle, 1995; Porter e Rose, 2012). Interessantemente quando esta definição é aplicada na análise de proteínas com dobramento (β/α)₈ barril identificam-se 2 domínios, que correspondem as suas metades N- e C-terminais (Porter e Rose, 2012), contrastando com a visão que assume o (β/α)₈ barril como um domínio único. Deste modo, considerando então que as metades N-terminal e C-terminal das proteínas (β/α)₈ barril sejam consideravelmente estáveis e independentes, o objetivo geral desta tese foi avaliar como as propriedades individuais destes subdomínios (β/α)₄ se combinam e definem tanto a estabilidade quanto a atividade catalítica das β-glicosidases GH1, que possuem estrutura (β/α)₈ barril. As β-glicosidases bglA de Thermotoga marítima (uma bactéria termófila), bglA e bglB de Paenibacillus polymyxa (uma bactéria mesófila) e proteínas quiméricas originadas da combinação dos subdomínios (β/α)₄ entre duas destas β-glicosidases (N_bglThm-C_bglB, N_bglB-C_bglThm, N_bglThm-C_bglA, N_bglA-C_bglThm, N_bglA-C_bglB e N_bglB-C_bglA) foram os modelos experimentais. As β-glicosidases bglA, bglB e bglThm foram produzidas como proteínas recombinantes e purificadas. Apenas N_bglA-C_sbglThm pode ser purificada solúvel e ativa. A fluorescência de triptofanos e o dicroísmo circular sugerem que as β-glicosidases selvagens e a quimera estão enoveladas. Além disso, N_bglA-C_bglThm apresenta uma composição de estrutura secundária mais próxima à bglA do que bglThm. Por outro lado, o acesso do supressor acrilamida aos triptofanos de N_bglA-C_bglThm é igual a bglThm e menor do que bglA. A T_m e o K_obs de inativação a 47°C de N_bglA-C_bglThm são intermediárias àquelas de bglA e bglThm. Portanto, a termoestabilidade da quimera é uma ponderação daquela das suas proteínas parentais. N_bglA-C_bglThm possui atividade enzimática independente do pH, enquanto bglA e bglThm exibem uma curva em sino. Ainda, N_bglA-C_bglThm mostrou menor atividade enzimática, ilustrada pela queda dos k_cat para os substratos estudados. Considerando que funcionamento do sítio ativo das β-glicosidases depende do posicionamento relativo de pelo menos dez resíduos, estas mudanças na quimera não são inesperadas. N_bglA-C_bglThm possui K_m intermediário para os substratos pNPβ- Gluco e pNPβ-Fuco em relação a bglA e bglThm. Adicionalmente, a especificidade pelo substrato de N_bglA-C_bglThm é uma ponderação daquela de bglA e bglThm, pois enquanto estas parentais exibiram preferência por um destes substratos, a quimera apresenta o mesmo k_cat/K_m para os dois. Deste modo, a caracterização da atividade enzimática sugere que as metades (β/α)₄ que compõem a quimera N_bglA-C_bglThm provavelmente se dobraram autossuficientemente e se ajustaram formando um sítio ativo funcional. Coerentemente, a estabilidade térmica intermediária da quimera também sugere que as metades (β/α)₄ das proteínas parentais mantiveram sua termoestabilidade relativamente independente. Em conjunto estas observações implicam em razoável estabilidade e independência termodinâmica no dobramento de cada uma das metades (β/α)₄, funcionando, portanto, como unidades praticamente independentes, ou seja, como domínios.

Domains are stable and independent folding units that compose the protein structure (Richardson, 1981; Dootlitle, 1995; Porter e Rose, 2012). Interestingly, the application of this definition in the analysis of (β/α)₈ barrel proteins reveals two domains corresponding to the N- and C-terminal halves (Porter and Rose, 2012), a perspective that contrast with the common assumption that those are single domain proteins. Based on that, assuming that the N- and C-terminal halves of the (β/α)₈ barrel proteins are stable and independent, the objective of this project was to understand how the individual properties of the (β/α)₄ subdomains combine and define the stability and catalytic activity of the β-glycosidases GH1, which exhibit (β/α)₈ structure. The β-glycosidase bglThm from Thermotoga maritima (thermophile bacteria), bglA and bglB from Paenibacillus polymyxa (mesophile bacteria) and six chimeric proteins combining the (β/ α)₄ subdomains from two of those enzymes (N_bglThm-C_bglB, N_bglB-C_bglThm, N_bglThm-C_bglA, N_bglA-C_bglThm, N_bglA-C_bglB e N_bglB-C_bglA) were used as experimental models. bglA, bglB and bglThm were produced as recombinant proteins and successfully purified. The chimera N_bglA-C_bglThm was the only one that was viably produced and purified. Tryptophan fluorescence and circular dichroism spectra indicated that the wild-type and the chimeric β-glycosidases were folded. N_bglA-C_bglThm has a secondary structure composition similar to bglA. On the other hand, access of the tryptophan residues of N_bglA-C_bglThm to the quencher acrylamide is comparable to bglThm. The melting temperature (T_m) and the thermal inactivation rate constant (at 47°C) of the N_bglA-C_bglThm are intermediary to bglA and bglThm. Hence, the chimera thermostability is a balance of the parental enzymes stabilities. The catalytic activity of N_bglA-C_bglThm does not depend on the pH, whereas bglA and bglThm exhibited a typical bell shaped curve. In addition, N_bglA-C_bglThm activity is lower than the parental enzymes, as showed the k_cat for three different substrates. Considering that the active site properties of the β-glycosidases rely on the relative positioning of at least ten residues, such changes are not surprising. The K_m of N_bglA-C_bglThm for substrates pNPβ-Gluco and pNPβ-Fuco are intermediary to bglA and bglThm. Finally, the substrate specificity of the N_bglA-C_bglThm is a balance of the parental enzymes specificities, because they showed clear preference for one of those substrates, whereas the chimera presented the same k_cat/K_m for both. Hence, the characterization of the chimera activity indicates that the (β/α)₄ subdomains folded self-sufficiently and adjusted itself to form a functional active site. In agree, the chimera thermostability also indicates that the (β/α)₄ subdomains kept their individual thermal-properties. These observations point to a sufficient thermodynamic stability in the folding and properties of each (β/α)₄ half, implying that they were virtually self-contained like true domains.