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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.46.2018.tde-24082018-092045
Documento
Autor
Nome completo
Fábio Fernando Alves da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2018
Orientador
Banca examinadora
Labriola, Leticia (Presidente)
Abdulkader, Fernando Rodrigues de Moraes
Meotti, Flavia Carla
Sampaio, Helena Cristina de Lima Barbosa
Título em português
Avaliação do papel de HSPB1 na modulação da autofagia induzida por PRL em células-beta
Palavras-chave em português
Autofagia
Diabetes tipo 1
HSPB1
Prolactina
Resumo em português
O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença metabólica, caracterizada pela desregulação glicêmica, que ocorre devido a um ataque autoimune. A insulinoterapia é o tratamento clássico para o DM1. Contudo, alguns pacientes que apresentam essa doença não respondem de forma eficiente a este tratamento e apresentam episódios frequentes de hipoglicemia severa e despercebida (pacientes hiperlábeis). Essas complicações comprometem de forma significativa a qualidade de vida dessas pessoas. O transplante de ilhotas é uma importante alternativa para o tratamento de pacientes hiperlábeis com DM1. No entanto, essa terapia apresenta restrições como a necessidade de mais de um doador por transplante e significativa morte das ilhotas devido ao estresse provocado pelo procedimento de isolamento, além da morte promovida pelo sistema imune do paciente nos primeiros momentos pós-transplante. A autofagia é um mecanismo de reciclagem de componentes citoplasmáticos que é fundamental para a homeostase celular. Em condições de estresse, este mecanismo é ativado acima do seu nível basal, promovendo a degradação de agregados proteicos e organelas defeituosas, evitando assim, danos celulares que comprometam a viabilidade da célula. Trabalhos realizados por nosso grupo têm mostrado a citoproteção que PRL promove em células-beta, reduzindo a apoptose induzida por citocinas pró-inflamatórias. Também demonstramos o papel essencial de HSPB1 na inibição de apoptose induzida por PRL após o tratamento com citocinas. Além disso, resultados recentes de nosso laboratório mostraram um aumento nos níveis de autofagia em células-beta após sua exposição a citocinas, bem como uma restauração a níveis normais na presença de PRL. Visando um melhor entendimento do papel da PRL na modulação da autofagia em células-beta, o objetivo desse projeto foi estudar se HSPB1 também é essencial no mecanismo de regulação da autofagia induzido por PRL.Para tal, fizemos experimentos em modelos de células-beta MIN6, MIN6 silenciadas para HSPB1 (MIN6-shHSPB1) e MIN6 com sequencia short hairpin aleatória (MIN6- SsC), medindo a morte celular através de ensaios de viabilidade, e ensaios de western blot para avaliar os níveis de marcadores de autofagia e fluxo autofágico (degradação de autofagossomos), tratando as células com citocinas, prolactina e indutores ou inibidores de autofagia. Os resultados mostraram que a modulação da autofagia ocasionada pela prolactina em células-beta se dá, em parte, através de HSPB1. O tratamento com prolactina foi capaz de inibir a morte celular induzida por citocinas, mesmo na presença de cloroquina, um bloqueador de autofagia, o que nos levou a concluir que a autofagia não é uma via envolvida na citoproteção de células beta induzida por PRL. Os resultados gerados nesse estudo contribuíram para uma melhor compreensão dos eventos moleculares induzidos por PRL em células-beta, e poderão permitir a inferência de novas abordagens que melhorem a citoproteção, cultura e transplante dessas células em pacientes com diabetes tipo 1.
Título em inglês
Unveiling the role of HSPB1 in PRL-induced autophagy modulation in beta-cells
Palavras-chave em inglês
Autophagy
HSPB1
Prolactin
Type 1 diabetes
Resumo em inglês
Type 1 diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by glycemic dysregulation, which occurs due to an autoimmune destruction of beta-cells. Insulin therapy is the gold standard treatment for DM1. However, some DM1 patients do not respond efficiently to this treatment and suffer frequent episodes of severe hypoglycemia unawareness. Since this complication jeopardizes the quality of life of these people, Islet transplantation is a therapeutic alternative indicated to treat these patients. However, besides the lack of enough organ donors, the loss of beta cells during both the isolation as well as the infusion of islets into the recipient induce a great estresse and thus a significant cell death is one of the drawbacks of this procedure. Autophagy is a mechanism of recycling cytoplasmic components and is essential for cellular homeostasis. Under estresse conditions, this mechanism is activated above basal levels, promoting the degradation of protein aggregates and defective organelles, thus avoiding cell damage that could compromise cell viability. Studies carried out by our group have shown not only that PRL promotes cytoprotection in beta-cells, reducing pro-inflammatory cytokines-induced apoptosis, but also that HSPB1 plays an essential role in this inhibition of apoptosis mediated by PRL after treatment with cytokines. Moreover, recent results from our laboratory showed an increase in autophagy levels in beta-cells after exposure to cytokines, as well as a restauration to normal levels in the presence of PRL. In order to better understand the role of PRL in the modulation of autophagy in these cells, the aim of this project is to study whether HSPB1 is also essential in the mechanism of autophagy regulation induced by PRL. Using MIN6 beta cell models where HSPB1 was silenced (MIN6-shHSPB1) or not (MIN6-SsC), we studied cell death by viability assays. Moreover, western blot assays were performed in order to assess levels of autophagy and autophagic flux markers in the cells.Our results showed that HSPB1 in one of the mediators of PRL-induced modulation of autophagy. Nevertheless, since hormonal treatment was still able to inhibit cytokinesinduced cell death even in the presence of chloroquin, an autophagy blocker, we conclude that autophagy is not a signaling pathway involved in PRl-induced beta-cell cytoprotection. Altogether, the results shown in this study may help to increase the knowledge of the molecular events induced by PRL in beta-cells, and may allow to infer new approaches to improve cytoprotection, culture and transplantation of these cells into type 1 diabetic patients.
 
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Data de Publicação
2018-08-28
 
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