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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.46.2018.tde-23042018-114148
Documento
Autor
Nome completo
Adriana Aparecida Paulucci
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2003
Orientador
Banca examinadora
Farah, Chuck Shaker (Presidente)
Cuccovia, Iolanda Midea
Pertinhez, Thelma de Aguiar
Schreier, Shirley
Sorenson, Martha Meriwether
Título em português
Fragmentos de tropomiosina - estudos da estabilidade conformacional e da interação cabeça-cauda
Palavras-chave em português
Biofísica
Miosina (Estudo)
Proteínas musculares (Estudo)
Resumo em português
A Tropomiosina (Tm) está diretamente envolvida no processo de regulação da contração muscular, que é controlado por um mecanismo alostérico que envolve Ca2+, troponina (Tn), actina (Ac) e miosina. A Tm é uma proteína flexível, de estrutura "coiled-coil", constituída de duas α-hélices com 284 aminoácidos cada uma. A molécula de Tm faz interações do tipo "cabeça-cauda" com outra molécula de Tm através da sobreposição de aproximadamente 8 a 15 resíduos da extremidade N- terminal de uma molécula com 8 a 15 resíduos da extremidade e-terminal da outra molécula de Tm. Desta maneira, em baixas forças iônicas, formam-se filamentos lineares através de um processo de polimerização. A estabilidade de regiões específicas da Tm pode ser importante para a sua função no controle da regulação da contração muscular. Além disso, a Tm pode ser usada como um modelo relativamente simples e de ocorrência natural para entendermos as interações intra- e intermoleculares que governam a estabilidade das "coiled-coils". Assim sendo, nós produzimos oito fragmentos recombinantes de Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50Hw), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) e um peptídeo sintético (Ac-Tm215-235) com a finalidade de investigar as estabilidades conformacionais relativas das diferentes regiões derivadas da metade C-terminal da proteína, a qual é conhecida por sua interação com o complexo troponina. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostram que os fragmentos que incluem os últimos 24 resíduos da molécula (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50HW), Tm220-284) estão completamente dimerizados a 10 µM (concentração do dímero em 50 mM de tampão fosfato, pH 7,0; 100 mM de NaCI; 0,5 mM de DTT e 0,5 mM de EDTA, 10°C), enquanto que fragmentos que não possuem o e-terminal nativo (Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) se encontram em equilíbrio monômero-dímero nestas condições. A presença de trifluoroetanol promove uma diminuição na razão [θ]222/[θ]208, observada por dicroísmo circular, em todos os fragmentos e induz a formação de trímeros estáveis apenas para aqueles contendo os resíduos 261-284. Estudos de desnaturação por uréia, acompanhados por dicroísmo circular e fluorescência, mostram que os resíduos 261-284 da tropomiosina são muito importantes para estabilidade da metade C-terminal da molécula. Além do mais, a ausência desta região promove um aumento na cooperatividade do desenovelamento induzido por uréia. Os experimentos de desnaturação por temperatura e por uréia mostram que o fragmento Tm143-235 é relativamente instável quando comparado com outros fragmentos de mesmo tamanho. Nós identificamos alguns fatores que podem estar contribuindo para a particular instabilidade desta região, incluindo repulsões inter-hélices entre resíduos em posições g e e' da repetição heptapeptídica, um resíduo carregado na interface hidrofóbica da "coiled-coil" e por fim, uma grande fração de resíduos β-ramificados localizados em posições d. Sabe-se que a não acetilação do N-terminal da molécula de Tm, bem como a ausência de alguns resíduos na sua extremidade C-terminal, fazem com que a Tm deixe de sofrer polimerização. Entretanto, trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório haviam mostrado que um fragmento de Tm recombinante (ASTm1-260), contendo a fusão dipeptídica Ala-Ser (que é conhecida por restaurar a capacidade de polimerização de Tm não acetiladas no N-terminal), polimerizava-se mais do que a proteína recombinante de tamanho integral (ASTm), apesar da deleção dos últimos 24 aminoácidos C-terminais. Para investigar com mais detalhes a natureza da interação cabeça-cauda, nós construímos dois fragmentos que compreendem a metade N-terminal da molécula de Tm, ASTm1-142 e nfTm1-142, o primeiro deles contendo uma fusão dipeptídica AS no N-terminal e o segundo com o N-terminal não acetilado, sem a fusão dipeptídica. Estes dois fragmentos foram empregados em ensaios de interação cabeça-cauda, realizados através de ensaios de desnaturação térmica acompanhados por dicroísmo circular, juntamente com três fragmentos da região C-terminal da Tm. Dois dos fragmentos e-terminais acabam na posição 260 (Tm167-260 e Tm143-260) e um deles termina na posição 284 (Tm220-284), que corresponde ao C-terminal nativo da proteína. Os resultados mostram que ocorre uma interação cabeça-cauda entre o fragmento N-terminal ASTm1-142 e todos os fragmentos C-terminais utilizados neste estudo. As moléculas recombinantes de Tm que terminam na posição 260 são, de fato, capazes de fazer interações cabeça-cauda independentemente do fato de elas se apresentarem instáveis nas condições estudadas. Inclusive, após a interação, ocorre um aumento considerável na estrutura a-hélice, o que se dá preferencialmente nos fragmentos C-terminais.
Título em inglês
Fragments of tropomyosin - Studies of conformational stability and head-tail interaction
Palavras-chave em inglês
Biophysics
Muscle proteins (Study)
Myosin (Study)
Resumo em inglês
Tropomyosin (Tm) participates in the process of muscle contraction, which is controlled by an allosteric mechanism involving Ca2+, troponin (Tn), actin (Ac) and myosin. Tm is a coiled-coil flexible molecule composed by two α-helices with 284 amino acids each. Tm molecule performs head-to-tail interactions with another Tm molecule through the overlap of approximately 8 to 15 N-terminal residues of one molecule with 8 to 15 C-terminal residues of the other molecule. Thus Tm forms linear filaments in low ionic strengths, which is characteristic for a polymerization process. The stability of specific regions of Tm may be important to its function in controlling the regulation of muscle contraction. Besides, Tm can be used as a relatively simple model and of natural occurrence to understand the intra- and intermolecular interactions that govern the stability of "coiled-coils". We therefore produced eight recombinant fragments of Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) and one synthetic peptide (Ac-Tm215-235) to investigate the relative conformational stabilities of different regions derived from the C-terminal end of the molecule, which is known to interact with the troponin complex. Analytical ultracentrifugation experiments show that fragments comprising the last 24 residues of the molecule (Tm143-284(50Hw), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50Hw), Tm220-284) are completely dimerized at 10 µM (dimer concentration in buffer containing 50 mM phosphate, pH 7.0, 100 mM NaCI, 0.5 mM DTT and 0.5 mM EDTA, 10ºC), whereas the fragments that do not posses the native C-terminal portion (Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) present a monomer-dimer equilibrium at the same conditions. Trifluoroethanol promoted a decrease in the ratio [θ]222/[θ]208 for all fragments (observed by circular dichroism), and induced the formation of stable trimers for the fragments comprising the residues 261-284. Urea denaturation studies, followed by circular dichroism and fluorescence, show that residues 261-284 of Tm are very important for the stability of the C-terminal half of the molecule. Still, the absence of this region promotes an increase in the cooperativity of unfolding induced by urea. Urea and temperature denaturation experiments showed that the fragment Tm143-235 is relatively unstable when compared to other fragments of the same size. We identified some factors that may be contributing to the particular instability of this region, including interhelix repulsions between residues in positions g and e' of the heptad repeat, a charged residue in the hydrophobic interface of the coiled-coil and a great fraction of (β-branched residues located at d positions. It is known that the non-acetylation of the N-terminus of the Tm molecule, as well as, the absence of some residues in the C-terminus of the molecule cause Tm to loose its ability to undergo polymerization. Former works performed in our laboratory showed that a fragment of recombinant Tm (ASTm1-260) with the dipeptide fusion Ala-Ser (which is known by its ability in restores the polymerization of non-acetylated Tms), despite the absence of the C-terminal 24 amino acids, polymerizes to a much greater extent than the corresponding full length recombinant protein. To better investigate the nature of the head-to-tail interaction we constructed two fragments that comprise the N-terminal half of the Tm: ASTm1-142 and nfTm1-142, the former containing the dipeptide AS (Ala-Ser) fusion to its N-terminus, and the latter presenting a bare non-acetylated N-terminus without the dipeptide fusion . These two fragments were employed in thermal denaturation assays followed by circular dichroism to test their head-to-tail interaction along with three fragments comprising Tm's C-terminal region. Two of the C-terminal fragments ends at position 260 (Tm167-260 and Tm143-260), whereas one ends at position 284 (Tm220-284). Results show that there is a head-to-tail interaction between the N-terminal fragment ASTm1-142 and all other e-terminal fragments employed in this study. Recombinant Tm molecules ending at position 260, are capable of performing head-to-tail interactions, regardless of their stability under the studied condition. Upon interaction, an increase in the a-helix content occurs preferentially in the e-terminal fragments.
 
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Data de Publicação
2018-04-23
 
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