• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.46.2012.tde-23042013-143018
Documento
Autor
Nombre completo
Erik Halcsik
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2012
Director
Tribunal
Sogayar, Mari Cleide (Presidente)
Ho, Paulo Lee
Kobarg, Jorg
Serrano, Solange Maria de Toledo
Zaha, Arnaldo
Título en portugués
Fosfoproteômica e proteômica quantitativa de células mesenquimais durante a diferenciação osteoblástica mediada por BMP2, expressão e purificação de diferentes tipos de proteínas morfogenéticas ósseas
Palabras clave en portugués
Clonagem e expressão
Diferenciação celular
Fosfoproteômica
Osteoblastogênese de células mesenquimais
Proteínas morfogenéticas ósseas
Proteômica
Resumen en portugués
As fraturas e perdas ósseas representam altos riscos para o Sistema público de Saúde (SUS), além de afetar a qualidade de vida do paciente, portanto é necessário o entendimento das bases moleculares que envolvem os mecanismos de reparo ósseo. Citocinas secretadas por células do sistema imune presentes no local da inflamação, como as IL-6, IL-10 e TNFα atuam como fatores quimiotáticos para células mesenquimais, que proliferam e se diferenciam em osteoblastos pela ação autócrina e parácrina de Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs), principalmente a BMP2. Embora seja conhecido que a ação de BMP2 ocorra através de sua ligação nos receptores ActRI/BMPR, que ativam proteínas SMADS 1/5/8 efetoras, pouco se sabe sobre os mecanismos intracelulares que participam do processo de diferenciação osteoblástico. Neste estudo propôs-se analisar as diferenças no conteúdo de proteínas totais e de proteínas fosforiladas em células mesenquimais de pele induzidas à osteogênese pelo tratamento com BMP2 por diferentes períodos de tempo, utilizando-se de Isótopos Estáveis de Dimetila acoplado ao LC/MS. A partir de 150µg de material inicial, foi possível identificar 2.264 proteínas, as quais foram quantificadas nos diferentes pontos de indução, sendo que 235 são fosforiladas. Análise de motivos de quinases mostrou que diversos substratos possuem sítios fosforilados correspondentes àqueles dos motivos de fosforilação das quinases Casein Kinase, p38, CDK e JNK. A análise da ontologia gênica mostrou um aumento de processos biológicos relacionados com sinalização e diferenciação após a primeira hora de indução com rhBMP2. Além disso, proteínas envolvidas com o rearranjo do citoesqueleto e com vias de sinalização Wnt e Ras foram encontradas como tendo fosforilação diferencial durante todos os períodos estudados. Os dados revelaram novos substratos intracelulares que são fosforilados nos primeiros momentos do comprometimento com a diferenciação osteoblástica mediada pelo tratamento com rhBMP2 em células mesenquimais derivadas da pele. Além disso, clones celulares que superexpressam as proteínas recombinantes humanas BMP2 e BMP4 foram gerados, e sua atividade verificada in vitro. Paralelamente, a rhBMP7, obtida anteriormente, foi purificada por cromatografia de afinidade utilizando-se uma coluna de Heparina-Sepharose, que foi posteriormente utilizada para ensaios in vitro e in vivo, nos quais se mostrou capaz de gerar osteoblastos e tecido ósseo, respectivamente, o que abre novas possibilidades para o uso destas proteínas como biofármacos no Brasil.
Título en inglés
Quantitative phosphoproteomics and proteomics of mesenchymal stem cells during BMP2-mediated osteoblastic differentiation, expression and purification of different types of bone morphogenetic proteins
Palabras clave en inglés
Bone morphogenetic proteins
Cell differentiation
Cloning and expression
Osteoblastogenesis
Phosphoproteomics
Proteomics
Resumen en inglés
Bone fractures and loss represent significant costs for the public health system and often affect the patients quality of life, therefore, understanding the molecular basis for bone regeneration is essential. Cytokines, such as IL-6, IL-10 and TNFα, secreted by inflammatory cells at the lesion site, at the very beginning of the repair process, act as chemotactic factors for mesenchymal stem cells, which proliferate and differentiate into osteoblasts through the autocrine and paracrine action of bone morphogenetic proteins (BMPs), mainly BMP-2. Although it is known that BMP-2 binds to ActRI/BMPR and activates the SMAD 1/5/8 downstream effectors, little is known about the intracellular mechanisms participating in osteoblastic differentiation. We assessed differences in the phosphorylation status of different cellular proteins upon BMP-2 osteogenic induction of isolated human skin mesenchymal stem cells using Triplex Stable Isotope Dimethyl Labeling coupled with LC/MS. From 150 µg of starting material, 2,264 proteins containing two or more peptides were identified and quantified at five different time points, 235 of which are differentially phosphorylated. Kinase motif analysis showed that several substrates display phosphorylation sites for Casein Kinase, p38, CDK and JNK. Gene ontology analysis showed an increase in biological processes related with signaling and differentiation at early time points after BMP2 induction. Moreover, proteins involved in cytoskeleton rearrangement, Wnt and Ras pathways were found to be differentially phosphorylated during all timepoints studied. Taken together, these data, allow new insights on the intracellular substrates which are phosphorylated early on during commitment to BMP2-driven osteoblastic differentiation of skin-derived mesenchymal stem cells. Cell clones overexpressing the human BMP 2 and 4 recombinant proteins were also generated, and their biological activity was confirmed in vitro. In parallel, chromatography-affinity purified rhBMP7, obtained using heparin-Sepharose columns, was used for in vivo and in vitro assays to evaluate the ability of this purified protein to generate osteoblasts and bone tissue, respectively, opening new avenues for the use of these proteins as biopharmaceuticals in Brazil.
 
ADVERTENCIA - La consulta de este documento queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso:
Este documento es únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro. Esta reserva de derechos afecta tanto los datos del documento como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes del documento es obligado indicar el nombre de la persona autora.
Fecha de Publicación
2013-05-18
 
ADVERTENCIA: Aprenda que son los trabajos derivados haciendo clic aquí.
Todos los derechos de la tesis/disertación pertenecen a los autores
CeTI-SC/STI
Biblioteca Digital de Tesis y Disertaciones de la USP. Copyright © 2001-2024. Todos los derechos reservados.