ACTH (hormônio adrenocorticotrópico) e fatores peptídicos de crescimento regulam a proliferação celular em células adrenocorticais. Resultados preliminares de ensaios biológicos, cromatografia de heparina-sefarose e "Westem blotting" indicaram a produção de fatores peptídicos de crescimento das famílias de PDGF e de FGF na linhagem celular adrenocortical Y-1. No entanto a relação entre o estímulo promovido por ACTH e a expressão de fatores peptídicos de crescimento e sua contribuição para o controle do ciclo celular em células adrenocorticais ainda não estão definidas. Os principais objetivos deste projeto consistiram em: 1. Detectar e caracterizar os fatores peptídicos de crescimento e seus correspondentes receptores expressos em células adrenocorticais; 2. Investigar a regulação da expressão de fatores peptídicos de crescimento sob o estímulo de ACTH; 3. Definir os mecanismos de ação para os fatores peptídicos de crescimento localmente expressos e sua contribuição na regulação do ciclo celular. Os modelos experimentais utilizados foram: a linhagem Y-1 de células tumorais de adrenocorticais de camundongo e culturas primárias de células adrenocorticais de rato. Os resultados obtidos foram: 1. Fatores peptídicos de crescimento e seus respectivos receptores, correspondentes a PDGF (A e B), FGF2 (isoformas de alto e de baixo peso molecular), IGF (1 e 2), TGFβ (1, 2 e 3), VEFG-A, TGFα e EGF, foram detectados por RT-PCR e confirmados por clonagem e sequenciamento; 2. mRNAs correspondentes às formas de "splicing" alternativo para FGF2, bem como as isoformas de baixo (LMW-FGF2) e de alto (HMW-FGF2) peso molecular para a proteína FGF2 foram detectados em células Y-1. Os níveis basais de LMW-FGF2 foram aumentados sob estímulo de ACTH; 3. Com relação à distribuição subcelular em células adrenocorticais, LMW-FGF2 endógeno (produzido sob estímulo de ACTH) foi encontrado predominantemente no citoplasma, enquanto LMW-FGF2 exógeno (recombinante) foi internalizado para o núcleo de maneira dose e tempo-dependente; 4. Receptores para FGF foram detectados e caracterizados em células adrenocorticais. As isoformas detectadas, correspondentes a FGFRlb, FGFR2c e FGFR3b, foram reguladas sob tratamentos de ACTH e de FGF2. A expressão de FGFRs foi silenciada utilizando-se RNAs de interferência (RNAi), permitindo investigar a contribuição da sinalização promovida por FGF e seus receptores no ciclo celular.

ACTH and locally produced peptide growth factors regulate the proliferation in adrenocortical cells. Our previous results of biological assays, heparin-sepharose chromatography and Western blot indicated that PDGF and FGF-like factors are synthesized in Y-1 adrenocortical cell line. But the interaction among the ACTH stimulation and locally produced peptide growth factors, and their contribution for the cell cycle control, remains to be investigated. The main objectives of these project were: 1. To characterize peptide growth factors and their respective receptors expressed in adrenocortical cells; 2. To investigate the regulation of the expression of peptide growth factors under ACTH stimulation; 3. To find the mechanism of action of the locally produced peptide growth factors and to determine their contribution in the cell cycle control. The experimental models utilized were the Y-1 mouse adrenocortical cell line and primary cultures from rat adrenocortex. The results found were: 1. Several peptide growth factors and their respective receptors, corresponding to PDGF (A and B), FGF2 isoforms, IGF (1 and 2), TGFβ (1 , 2 and 3), VEGF-A, TGFα and EGF were detected by RT-PCR and confirmed by cloning and sequencing; 2. Two mRNAs splicing variants, as well the low (LMW-FGF2) and the high (HMW-FGF2) molecular weigh isoforms for FGF2 were detected in adrenocortical cells. The very low basal level of the endogenous LMW-FGF2 in untreated cells was up regulated after the ACTH stimulation; 3. In regard to the intracellular distribution of FGF2 in adrenocortical cells, the endogenous (ACTH induced) LMW-FGF2 was found predominantly in he cytoplasm, but the exogenous (recombinant) LMW-FGF2 was internalized into the nucleus in a time and dose dependent manner; 4. FGFRs corresponding to FGFRlb, FGFR2c and FGFR3b isoforms were detected and characterized in adrenocortical cells. All of them were up regulated under ACTH and FGF2 treatments. The expression of FGFRs could be silenced by RNAi approach, allowing to investigate the contribution of the FGF signaling for the cell cycle control.