A oxidação do DNA por espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio molecular singlete [O₂ (¹Δ_g)] , pode estar relacionada ao aparecimento de mutações e ao desenvolvimento de doenças. O O₂ (¹Δ_g) pode ser gerado biologicamente por reação de fotossensibilização, pela reação de H₂O₂ e HOCl e pela decomposição de peróxidos orgânicos contendo hidrogênio alfa (α-ROOH), na presença de metais de transição (Fe²⁺, Cu²⁺) ou HOCl. A decomposição de α-ROOH, como hidroperóxidos de lipídeos ou proteínas na presença de metais de transição, pode gerar O₂ (¹Δ_g) via mecanismo de Russell. Neste mecanismo, a oxidação de α -ROOH gera radicais peroxila, que podem reagir entre si, formando um intermediário tetraóxido linear. Este intermediário tetraóxido linear pode decompor através de um mecanismo cíclico e produzir O₂ (¹Δ_g), um álcool e um composto carbonílico. Como a decomposição de α-ROOH pelo mecanismo de Russell pode ser uma importante fonte biológica de O₂ (¹Δ_g) decidimos investigar se o α-hidroperóxido de timina, 5-(hidroperoximetil)uracil (5-HMPU), poderia gerar esta espécie reativa na presença de metais (Ce⁴⁺, Fe²⁺, Cu²⁺) e HOCl. Outro objetivo foi avaliar os efeitos oxidativos, em DNA plasmidial (pBR322), da decomposição de 5-HPMU na presença de Cu²⁺. A geração de O₂ (¹Δ_g) na reação de 5-HPMU e Ce⁴⁺ ou HOCl foi demonstrada por meio do monitoramento da emissão de luz monomolecular de O₂ (¹Δ_g) na região do infravermelho próximo (IR-próximo, λ = 1270 nm) e bimolecular na região do visível (λ = 634 e 703 nm). A aquisição do espectro de emissão de O₂ (¹Δ_g) forneceu evidências inequívocas da geração desta espécie reativa na reação de 5-HPMU e Ce⁴⁺ ou HOCl. Além disto, a formação de O₂ (¹Δ_g) na reação de 5-HPMU e Fe²⁺, Cu²⁺ ou HOCl foi demonstrada através da captação química de O₂ (¹Δ_g) utilizando 9,10- divinilsulfonatoantraceno (AVS) e detecção por HPLC/MS/MS do endoperóxido (AVSO₂₎ formado. A detecção por HPLC/MS/MS dos produtos de decomposição de 5-HPMU, 5- (hidroximetil)uracila (5-HMU) e 5-formiluracila (5-FoU), reforçaram a hipótese de geração de O₂ (¹Δ_g) pelo mecanismo de Russell. A análise dos resultados da incubação de pBR322, 5-HPMU e crescente concentração de Cu²⁺ mostraram o aumento da forma circular aberta (OC), indicando a formação de quebra de fita simples do DNA, provavelmente proveniente da presença dos radicais peroxila e alcoxila de 5-HPMU. Já a utilização das enzimas de reparo FPG e NTH na incubação de pBR322, 5-HPMU e Cu²⁺ forneceu evidências da formação preferencial de purinas oxidadas, especialmente de 2’-desoxiguanosina (dGuo). O aumento significativo da forma OC na presença de FPG indicou a formação de 8-oxo-2’-desoxiguanosina, resultante da oxidação da dGuo por O₂ (¹Δ_g) e/ou pelos radicais derivados de 5-HPMU. Podemos concluir que 5-HPMU pode ser uma importante fonte biológica de O₂ (¹Δ_g) . Além disto, a presença de 5-HPMU pode levar a propagação dos danos oxidativos no DNA, pois sua decomposição pode gerar radicais peroxila e alcoxila

Oxidation of DNA by singlet molecular oxygen O₂ (¹Δ_g) can be involved in the development of mutations and diseases. In vivo, O₂ (¹Δ_g) can be generated by photosensitization reaction, H₂O₂ and HOCl reaction and decomposition of organic hydroperoxides with α-hydrogen (α-ROOH) in the presence of metal ions (Fe²⁺, Cu²⁺) or HOCl. The α-ROOH decomposition, such as lipid or protein hydroperoxides in the presence of metal ions or HOCl can generate O₂ (¹Δ_g) by Russell mechanism. In this mechanism, the self-reaction of peroxyl radicals generates a linear tetraoxide intermediate that decomposes to O₂ (¹Δ_g) , an alcohol and an aldehyde. Therefore, the purpose of this work is to investigate if O₂ (¹Δ_g) can be generated by α-thymine hydroperoxide, 5- (hydroperoxymethyl)uracil (5-HPMU) in the presence of Ce⁴⁺, Fe²⁺, Cu²⁺ or HOCl. Another purpose is to study base modification and strand breaks formation in plasmid DNA (pBR322) by 5-HPMU decomposition in the presence of Cu²⁺. The generation of O₂ (¹Δ_g) in the reaction of 5- HPMU and Ce⁴⁺ or HOCl was monitored by monomol light emission in the near-infrared region (NIR, λ = 1270 nm) and dimol light emission in the visible region (λ = 634 e 703 nm). The generation of O₂ (¹Δ_g) during the reaction of 5-HPMU and Ce⁴⁺ or HOCl was confirmed by acquisition of the light emission spectrum in the NIR. Furthermore, the generation of O₂ (¹Δ_g) produced by 5-HPMU and Fe²⁺, Cu²⁺ or HOCl was also confirmed by chemical trapping using anthracene-9,10-divinylsulfonate (AVS) and HPLC/MS/MS detection of the corresponding endoperoxide (AVSO₂). The detection by HPLC/MS/MS of 5-(hydroxymethyl)uracil (5-HMU) and 5-formyluracil (5-FoU), two 5-HPMU decomposition products, support the Russell mechanism. Plasmid results from pBR322, 5-HPMU and Cu²⁺ reaction showed formation of DNA open circular form (OC), probably produced by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. Additionally, the reaction of pBR322, 5-HPMU and Cu²⁺ following by Fpg and NTH enzyme treatment demonstrated evidences of purine modification, especially 2’-deoxyguanosine (dGuo). The use of FPG enzyme indicated the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, a dGuo oxidation product formed by O₂ (¹Δ_g) and/or 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. We can conclude that 5-HPMU can be a biological source of O₂ (¹Δ_g)] and 5-HPMU decomposition can lead to an enhancing of DNA oxidative damage by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals formation