Este estudo descreve um novo método para a produção da Ca²⁺-ATPase do retículo sarcoplasmático de coelho em levedura utilizando um vetor de expressão regulado por choque térmico. Após solubilização das membranas de levedura com lisofosfatidilcolina, a introdução de um "tag" de 6 histidinas na extremidade amino-terminal da Ca²⁺-ATPase permitiu a sua purificação por cromatografia de afinidade utilizando uma resina carregada com níquel. Utilizando essa estratégia, foi possível obter frações enriquecidas em até 75% de Ca²⁺-ATPase recombinante, algo não descrito ainda na literatura. A 6xHis Ca²⁺-ATPase solubilizada em LPC e purificada em coluna de níquel se mantém estável desde que seja introduzido DOPC juntamente com o detergente nas etapas de lavagem e eluição. Nessas condições, a enzima purificada possui elevada atividade ATPásica cálcio-dependente (1.5-2.0 µmol/mg proteína.min) durante vários minutos de reação. A titulação da atividade ATPásica em função do cálcio livre demonstrou que a 6xHis Ca²⁺-ATPase purificada possui alta afinidade para o íon (K_0.5= 0.15 µlM) e manteve uma forte cooperatividade na ativação por cálcio (n_H = 2.07). A quantidade e o grau de pureza obtidos são suficientes para permitir a caracterização bioquímica e espectroscópica de mutantes pontuais da Ca₂₊-ATPase já construídos e expressos em levedura. A conversão da energia presente em ligações químicas em gradiente eletroquímico é um tema central da bioenergética. Espera-se que o estudo dos mutantes pontuais de triptofano da Ca²⁺-ATPase gerados nesse trabalho contribua para uma melhor compreensão do mecanismo de acoplamento entre a hidrólise de ATP e o transporte vetorial de íons nesse modêlo de estudo de proteínas de transporte.

We describe in this work a new method for the production of SERCA-l Ca²⁺-ATPase in yeast using a heat-shock regulated expression vector. Following solubilization of yeast membranes with lysophospholipids, the presence of an hexahistidine tag introduced at the Nterminal end of the Ca²⁺-ATPase allowed its purification by metal chelating affinity chromatography using a nickel-NTA resin. Using this procedure highly enriched ftactions (75% oftotal protein in the ftaction) of yeast-expressed rabbit Ca²⁺-ATPase were obtained. Detergent-solubilized 6xHis-Ca²⁺-ATPase retained highly active (1.5 - 2 µmol/mg protein .min) calcium-dependent, vanadate inhibitable ATPase activity as determined by ³²P-γ-ATP hydrolysis. Titration of ATPase activity as a function of ftee calcium revealed high Ca²⁺ affinity (K_0.5 =~ 0.15 µM) and the persistence of a strong cooperative pattem of calcium activation (Hill number of 2.07). The yield and purity of 6xHis Ca²⁺-ATPase fractions produced with this method allows the biochemical and spectroscopic characterization of Ca²⁺-ATPase mutants produced in the course of this work. Conversion of the energy present in chemical bonds to electrochemical gradient is a central theme of bioenergetics. It is hoped that the study of the Ca²⁺-ATPase tryptophan mutants generated in this work will contribute to a better understanding of the coupling mechanism between ATP hydrolysis and the vectorial transport of ions across membranes that occur in this model system.