Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, as oscilações da concentração de cálcio intracelular livre resultam na proliferação celular, migração e diferenciação neuronal. Nesta tese foram investigadas a participação dos receptores ionotrópicos purinérgicos dos tipos P2X2 e P2X4 seletivos ao influxo de cálcio durante a diferenciação neuronal in vitro das células de carcinoma embrionário murino P19. Identificamos o padrão diferencial de expressão de receptores purinérgicos nas células indiferenciadas e neurônios P19. O receptor P2X₄ é expresso durante toda a diferenciação neuronal e o receptor P2X₂ é detectado na fase tardia da diferenciação em neurônios. Através de ensaios farmacológicos, foi possível identificar a participação dos receptores metabotropicos P2Y e do receptor P2X₄ na formação dos corpos embriônicos, na proliferação celular e ou na determinação do fenótipo de progenitor neural. Durante a maturação neuronal os receptores P2X₂ e P2Y₁ participam da determinação do fenótipo neuronal glutamatérgico NMDA e os receptores P2X₂ e P2Y₂ no fenótipo neuronal colinérgico. A ausência de inibidores específicos e seletivos aos receptores purinérgicos levou-nos a empregar a técnica SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) a fim de identificar inibidores seletivos aos receptores P2X₂ e P2X₄. A técnica envolve a utilização da biblioteca combinatória randômica de RNA 2'- F pirimidina modificadas resistentes a nucleases. Após 9 ciclos de seleção in vitro de SELEX (ciclo 9-P2X₄), as sequências selecionadas mostraram-se seletivas a ligação somente ao receptor P2X₄ e não aos receptores P2X₂ ou P2X₇ através de ensaios de ligação radioligante-receptor. Por patch clamping na configuração whole cell recording identificou-se que além de seletividade ao receptor, que a aplicação do RNA ciclo 9- P2X₄ promoveu inibição da corrente ativada pelo ATP somente nos receptores P2X4 e não em P2X₂ em celulas 1321N1 astrocitoma transfectadas. A incubação do RNA ciclo 9-P2X₄ na concentração de 200 nM com as células no estágio indiferenciado inibiu a formação dos corpos embriônicos. Já utilização de 25 nM, resultou em mudanças morfológicas nas células diferenciadas. Estes dados corroboram com os dados farmacológicos que identificaram a participação do receptor P2X₄ na diferenciação precoce. Após 11 ciclos P2X₂ de seleção, identificou-se sequências com especificidade de ligação aos receptores P2X₂. Aptâmeros, moleculas de RNA com sequência identificada e com alta afinidade ao alvo da seleção, foram isolados de ambas as bibliotecas, ciclo 9 P2X₄ e ciclo 11 P2X₂. A co-aplicação destes aptâmeros e ATP em ensaios de whole-cell recording resultou na inibição de 30 a 80% da corrente ativada pelo ATP nos receptores P2X₂ ou P2X₄. Estes testes em células PC12 de rato, que expressa os receptores endógenos, resultou em inibição da corrente ativada pelo ATP de modo semelhante. Além de termos desenvolvido aptâmeros como ferramentas para elucidar as funções dos receptores P2X₂ e P2X₄ durante o desenvolvimento, diferenciação, em processos fisiológicos e patológicos, estas moléculas resistentes a nucleases são as primeiras identificadas capazes de reconhecer, discernir e inibir dois subtipos de receptores purinérgicos sendo promissores para utilização terapêutica.

During the development of the nervous system, oscillations of intracellular calcium concentrations activate programs of gene expression resulting in proliferation, migration and neuronal differentiation of embryonic cells. In this thesis, the participation of ionotropic P2X₂ and P2X₄ receptor subtypes, whose receptor channels are highly permeable for calcium influx in the cells, was studied during the process of neuronal differentiation. We have identified differential gene expression of purinergic receptors in undifferentiated and neuronal-differentiated P19 cells. P2X₄ receptor expression was present along neuronal differentiation of P19 cells, whereas P2X₂ receptor expression was only detected when P19 cells became neurons. Based on purinergic receptor pharmacology we have determined the participation of P2X₄ receptors in addition to metabotropic P2Y₂ receptors in the formation of embryonic bodies as prerequisites for phenotype determination of P19 neural progenitor cells. Final neuronal maturation of P19 cells in the presence or absence of agonists or antagonists of purinergic receptors implicated the involvement of P2X₂, P2Y₁, and P2Y₂ in the determination of the final neuronal phenotype, such as expression of NMDA-glutamate and cholinergic receptors. In order to further evaluate the functions of these P2X receptors and due to the absence of specific inhibitors for these receptor subtypes, we have used the SELEX technique (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) to select for specific inhibitors for P2X₂ and P2X₄ receptors. The 2' -F-pyrimidine modified, nuclease- resistant combinatorial SELEX RNA pool enriched with inhibitors of P2X₄ receptors following nine cycles of in vitro selection (cycle 9-P2X₄) specifically interacted with P2X₄ receptors and not with P2X₂ or P2X₇ receptors as verified in radioligand-receptor binding studies. Moreover, whole-cell recording measurements using astrocytoma cells expressing recombinant rat P2X₂ or P2X₄ receptors showed inhibition of P2X₄ but not of P2X₂ receptors by the selected RNA molecules. RNA molecules selected in vitro in 11 reiterative SELEX cycles using the P2X₂ receptor as target specifically bound to membrane extracts containing recombinant P2X₂ receptors. From both selected RNA libraries (against P2X4 and P2X₂ receptors) aptamers, as RNA molecules with identified sequences and high-affinity binding, were identified by cloning and DNA sequencing. The presence of these aptamers in whole-cell recording experiments resulted in 30-80% inhibition of ATP-induced receptor activity and did not provoke any inhibitory effects on P2X receptors which had not been used as selection target. The activity of the aptamers selected using recombinant receptors as targets in inhibiting wild-type P2X₄ or P2X₂ receptors was verified in whole-cell recording experiments with PC12 cells which endogenously express both receptor subtypes. In addition of having developed aptamers as tools to elucidate P2X₂ and P2X₄ receptor functions during neuronal differentiation, these nuclease-resistant aptamers are suitable for in vivo use and may turn into therapeutics in the inhibition of purinergic receptor participation in pathophysiological conditions.