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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.43.2014.tde-24032015-101105
Documento
Autor
Nome completo
Wagner Wlysses Rodrigues de Araujo
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2014
Orientador
Banca examinadora
Salvadori, Maria Cecilia Barbosa da Silveira (Presidente)
Added, Nemitala
Airoldi, Vladimir Jesus Trava
Alencar, Adriano Mesquita
Duailibi, Silvio Eduardo
Título em português
Modificação de superfícies para o uso em cultura de células
Palavras-chave em português
células CHO
DLC
Microfabricação.
Modificação de Superfícies
PDMS
SU-8
Resumo em português
O projeto de novos materiais para aplicações tecnológicas em biomateriais e bioengenharia é altamente dependente de como as células aderem à superfície de um material. A adesão e crescimento em biomateriais depende de propriedades do substrato, tais como molhabilidade da superfície, a topografia e a composição química de superfície. O objetivo deste estudo foi investigar as interações de diversos materiais com culturas celulares de células epitelial CHO (Ovário de Hamster Chinês). Os materiais utilizados foram SU-8 2005 (elétron-resiste, Microchem), PDMS (Poli (dimetil siloxano), Down Corning), DLC (Diamond-like Carbon) e vidro foi utilizado como referência. Superfícies de vidro, SU-8, PDMS e DLC lisas (planas) e isentas de modificação ou tratamento específico foram avaliadas quanto ao cultivo de células CHO. Valores médios dos fatores de forma (Ff) de 450 células foram calculados para cada uma das culturas realizadas sobre os 4 substratos. Foram obtidos Ff próximos a 0,52 para o vidro, o SU-8 liso e o DLC, demonstrando um bom espraiamento das células nessas superfícies. A superfície de PDMS apresentou valor unitário para o fator de forma (Ff), que está relacionado a um baixo espraiamento das células. A energia de superfície (ES) obtida para o PDMS é compatível com o resultado de fator de forma (Ff), uma vez que o menor valor para ES é coerente com a baixa adesão celular, o que gerou células com elevado fator de forma (Ff). O SU-8 foi modificado por implantação iônica com uma dose de 1,2x1016 átomos/cm2 e a energia de implantação foi de 8 keV, como referência foi utilizada uma superfície lisa de SU-8 sem implantação. Os resultados mostraram que o número de células vivas por unidade de área foi superior na superfície de SU-8 com prata implantada, mostrando o bom desempenho da cultura nesse substrato. As superfícies de DLC modificadas por tratamento com plasma de oxigênio (DLC-O) e com plasma de hexafluoreto de enxofre (DLC-F) foram utilizadas para cultura celular, os resultados de três experimentos independentes de contagem de número de núcleos (marcados com DAPI) por unidade de área confirmaram os resultados obtidos através do teste de viabilidade (marcados com trypan blue). A superfície de DLC-O, apresentou um maior número de núcleos por unidade de área, quando comparado à superfície DLC-F, da mesma forma que nos resultados obtidos pelo teste de viabilidade. As energias de superfície para as amostras de DLC-F e DLC-O indicaram que a superfície DLC-O é mais hidrofílica do que a superfície DLC-F, que está coerente com o que é conhecido da literatura e com os resultados obtidos em nosso trabalho. Cultura de células CHO foram realizadas em superfícies litografadas com estruturas hexagonais periódicas com o parâmetro 2R (diâmetro do círculo inscrito) sendo 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. Estas superfícies foram caracterizadas por microscopia óptica de fluorescência com relação ao número de núcleos (marcados com o fluoróforo DAPI) por unidade de área, isto é, núcleos/mm2. Obteve-se histogramas com o número médio de núcleos por mm2 em três experimentos independentes, onde o número núcleos/mm2 foi consideravelmente maior para 80 µm. As superfícies contendo cavidades periódicas de 12 µm e 30 µm apresentaram dificuldade para as células CHO aderirem à superfície. Em uma outra etapa realizou-se culturas celulares em triplicata dos substratos com as superfícies 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As células em cada uma das superfícies foram analisadas por microscopia óptica (MO) para avaliação da viabilidade celular, utilizando marcador trypan blue. Obteve-se histogramas com os valores médios para o número de células vivas/mm2 para as culturas celulares que corrobora os resultados obtidos no histograma da cultura celular que tiveram os núcleos marcados pelo fluoróforo DAPI. Assim, fica confirmado o melhor desempenho da cultura celular no substrato 80 µm que apresentou o maior número de células vivas/mm2 As micrografias obtidas através de marcação por DAPI foram analisadas através da função de correlação com intuito de se entender como as células estavam organizadas. Isso foi feito para cada uma das superfícies litografadas, 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As superfícies dos substratos 80 µm apresentaram os menores valores de distâncias para primeiros e segundos vizinhos, ou seja, as células estão mais próximas umas das outras. As demais superfícies tendem a separar mais as células. Obteve-se também os valores de raio de aglomerado (rc), distância entre os aglomerados (dc) e o número de primeiros vizinhos (Np) através do ajuste da função de correlação. A análise de correlação mostrou com clareza o que não era evidenciado apenas visualizando-se as imagens. Ela mostra que as células, mesmo em SU-8 liso tem a forte tendência de formar aglomerados de células com raio de aproximadamente 45 µm. No caso de substratos lisos, células CHO apresentaram a melhor adesão na superfície do SU-8, seguido do DLC, enquanto que o PDMS foi a pior situação, devido à baixa molhabilidade do material. No caso de superfícies com microestrutura, SU-8 contendo microcavidades hexagonais de 12 e 30 µm mostraram ser as situações mais adversas para o crescimento de células CHO, provavelmente por causa da topografia das cavidades serem de menor tamanho quando comparadas ao tamanho das células CHO. Em vez disso, SU-8, contendo microcavidades hexagonais de 80 µm foi a superfície mais favorável para o crescimento de células CHO.
Título em inglês
Surface modification for use in cell culture
Palavras-chave em inglês
CHO cell
DLC
Microfabrication.
PDMS
SU-8
Surface modification
Resumo em inglês
The design of new materials for technological applications in biomaterials and bioengineering is highly dependent on how the cells adhere to the material surface. The cells adhesion and growth on biomaterials depends on substrate properties such as surface wettability, topography and the chemical composition. The aim of this study was to investigate the interactions of various materials with cell cultures of epithelial cells CHO (Chinese Hamster Ovary). The materials used were SU-8 2005 (electron resists, Microchem), PDMS (poly (dimethyl siloxane), Dow Corning), DLC (Diamond-like Carbon) and glass was used as reference. Unmodified and flat surfaces of glass, SU-8, PDMS and DLC were evaluated for the culture of CHO cells. Form factor (Ff) values were calculated as average of 450 cells for each of the cultures performed on the four substrates. Ff close to 0.52 was obtained for flat surfaces of glass, SU-8 and DLC, showing a good cell spreading on these surfaces. The surface of PDMS presented a form factor (Ff) near unity, which is related to low spreading cell. The surface energy (ES) obtained for the PDMS is coherent with the Ff result, since the smallest value of ES is consistent with the low cell adhesion, which resulted in cells with a high Ff. The SU-8 was modified by ion implantation using a dose of 1.2x1016 atoms/cm2 and an implantation energy of 8 keV, unmodified flat SU-8 was used as a reference. The cell culture results showed that the number of live cells per unit area was greater in the SU-8 surface implanted with silver, showing a good performance in the culture substrate. The DLC surfaces modified by plasma treatment with oxygen (DLC-O) and sulfur hexafluoride (DLC-F) were used for cell culture. The results of three independent experiments, counting the number of nuclei (marked with DAPI) per unit area, confirmed the results obtained by the viability test (marked with trypan-blue). The surface of the DLC-O had higher number of nuclei per unit area when compared to the surface of the DLC-F, similarly to the results obtained for the viability test. The surface energies of the DLC-F and DLC-O samples indicated that the DLC-O surface is more hydrophilic than the DLC-F surface, which is consistent with results obtained with our work and with the literature. CHO cell culture were performed on surfaces with periodic hexagonal structures with the diameter of inscribed circle (2R) given by 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. These surfaces were characterized by fluorescence optical microscopy with respect to the number of nuclei (marked with fluorophore DAPI) per unit area, i.e. nuclei/mm2. Histograms were obtained for the average number of nuclei per mm2 in three independent experiments, where the substrate with periodic hexagonal structures with 2R = 80 µm presented considerably higher nuclei/mm2. Surfaces containing periodic cavities of 2R =12 µm and 30 µm were adverse for CHO cells adhesion. In another approach, cell culture were analyzed by light microscopy (LM) for evaluation of cell viability using trypan-blue marker. This was carried out in triplicate cell culture on substrates with surfaces 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. Histograms were generated for average number of living cells/mm2 for each substrate, which corroborates with the results obtained for the cell culture marked with fluorophore DAPI. Thus, it is confirmed the better performance of the cell culture on substrates with 2R = 80 µm, presenting the highest number of living cells/mm2. The micrographs obtained with cells marked with DAPI were analyzed through the correlation function with the aim of understanding how the cells were organized. This was performed for each of the lithographed surfaces 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also flat SU-8. The surfaces of the substrates with 2R = 80 µm had the lowest values for length between its neighbors, that is, the cells are closer to each other. The remaining surfaces tend to separate the cells. Also were obtained the cluster radius values (rc), the distance between the clusters (dc) and the number of nearest neighbors (Np) through the correlation function fitting. The correlation analysis clearly showed what was not possible to observe by viewing the images. It shows that the cells, even in flat SU-8, have a strong tendency to form clusters of cells within about 45 micrometers. In the case of flat substrates, CHO cells exhibited better adhesion to the surface of SU-8, followed by the DLC, while the PDMS was worse due to low wettability of the material. In the case of surfaces with microstructures, SU-8 containing hexagonal microstructures of 12 and 30 µm showed to be the most adverse conditions for the CHO cell growth, probably because of the topography of the cavities being smaller in size compared to the size of CHO cells. SU-8 with 80 µm hexagonal microstructures was more favorable surface for the growth of CHO cells.
 
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Data de Publicação
2015-04-02
 
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