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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.43.2019.tde-21032019-171115
Documento
Autor
Nome completo
Robert Garcia Checchia
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Itri, Rosangela (Presidente)
Ciancaglini, Pietro
Mertins, Omar
Título em português
Estudo de propriedades biofísicas de membrana sob estresse oxidativo e a interação com proteínas formadoras de poros
Palavras-chave em português
Azul de Metileno
Esticolisina I
Esticolisina II
GUVs
peroxidação lipídica
Vesiculas unilamelares gigantes
Resumo em português
Neste trabalho investigamos efeitos de fotoirradiação e toxinas sob membranas celulares miméticas. Foram utilizadas, como modelo de membranas lipídicas, vesiculas unilamelares gigantes (GUVs) compostas pro lipídeos oxidados e não oxidados observadas por microscopia ótica de contraste de fase. Inicialmente estudamos a foto-resposta de membranas compostas por POPC e POPG dispersas em solução contendo azul de metileno (MB). Na sequência, estudamos o efeito de toxinas formadoras de poros, Esticolisina I (ST I) e Esticolisina II (ST II), em membranas contendo lipídeos oxidados e não oxidados. Os resultados de MB (10 µM) disperso em solução de membranas compostas por POPC e o lipídeo aniônico POPG indicaram que o aumento da densidade de carga negativa nas membranas das GUVs, que favorece a ligação da moléculas positivamente carregadas como MB nas membranas, tem como consequência um aumento de permeabilidade da membrana muito mais rápído em relação a membranas compostas apenas por POPC. Isto se deve ao fato que a localização preferencial do MB na membrana de POPC:POPG favorece a formação de oxigênio singlete próximo a dupla ligação da cadeia alquílica, dando início a reação de peroxidação lipídica de maneira mais efetiva que em membrana de POPC. Os resultados da ação das toxinas STI e STII (21 nM) em GUVs contendo lipídeos não oxidados PC e esfingomielina evidenciam que apenas STII é capaz de permear estas membranas a esta concentração. Mais ainda, nossos resultados sugerem que a existência de separação de fases fluida-gel na bicamada lipidica composta por PC:SM (razão molar 1:1) favorece a ação da toxina StII. Ao analisarmos membranas contendo lipídeos hidroperoxidados (POPC-OOH) dispersas em solução contendo STII (21 nM) observamos um aumento de permeabilidade na membrana num conjunto de GUVs, associado a formação de poros, apenas em bicamadas lipídicas formadas por misturas de lipídeos oxidados (POPC) e não oxidados (POPC-OOH). Quanto maior a concentração de lipídeos oxidados na membrana mais rapidamente ocorre o aumento de permeabilidade.
Título em inglês
Study of biophysical properties in membranes under oxidative stress and interaction with pore-forming proteins
Palavras-chave em inglês
Giant unilamellar vesicles
GUVs
lipid peroxidation
Methylene Blue
Sticholysin I
Sticholysin II
Resumo em inglês
In this work we investigate the effects of photoirradiation and toxins on mimetic cell membranes. As a model of lipid membranes, giant unilamellar vesicles (GUVs) composed of oxidized and oxidized pro-lipids were observed by optical phase contrast microscopy. Initially we studied the photo-response of membranes composed of POPC and POPG dispersed in solution containing methylene blue (MB). Following, we studied the effect of pore-forming toxins, Sticolysin I (ST I) and Sticolysin II (ST II), on membranes containing oxidized and non-oxidized lipids. The results of MB (10 M) dispersed in solution of membranes composed of POPC and the anionic lipid POPG indicated that the increase in the negative charge density in the membranes of GUVs, which favors the binding of positively charged molecules as MB in the membranes, consequently increases membrane permeability in regard to membranes composed only of POPC. This is due to the fact that the preferred location of the MB in the POPC: POPG membrane favors the formation of singlet oxygen near the double bond of the alkyl chain, initiating the lipid peroxidation reaction more effectively than in the POPC membrane. The results of the action of the STI and STII toxins (21 nM) on GUVs containing non oxidised lipids PC and sphingomyelin show that only STII is able to permeate these membranes at this concentration. Moreover, our results suggest that the existence of fluid-gel phase separation in the lipid bilayer composed of PC:SM (molar ratio 1:1) favors the action of the StII toxin. When analyzing membranes containing hydroperoxidized lipids (POPC-OOH) dispersed in solution containing STII (21 nM) we observed an increase in membrane permeability in a set of GUVs, associated with pore formation, only in lipid bilayers formed by mixtures of oxidized lipids (POPC-OOH) and non-oxidized ones. The higher the concentration of oxidized lipids in the membrane, the faster the permeability increases.
 
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Data de Publicação
2019-03-22
 
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