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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.42.2018.tde-08102018-095239
Document
Auteur
Nom complet
Mariana Tamazato Longhi
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2018
Directeur
Jury
Cella, Nathalie (Président)
Coltri, Patricia Pereira
Gomes, Marcelo Damario
Labriola, Leticia
Lopes, Marilene Hohmuth
Titre en portugais
Mecanismos de regulação da localização subcelular de maspina em linhagem de células epiteliais de mama.
Mots-clés en portugais
EGFR
Fosforilação
Localização subcelular
Maspina
Sinalização
Resumé en portugais
Maspina, uma proteína supressora de tumor de 42 kDa, pertence à superfamília das serpinas (inibidores de serina protease), no entanto, seu mecanismo de ação independe da inibição de proteases. Maspina é expressa por epitélio de diferentes órgãos e apresenta regulação diferencial durante a progressão tumoral. Entre suas atividades biológicas, foram descritas a regulação da adesão celular, migração, morte, expressão gênica e resposta ao estresse oxidativo. A localização subcelular de maspina está relacionada a regulação de suas funções biológicas. Estudos clínicos recentes indicam que é a localização nuclear de maspina, ao invés de seus níveis de expressão, correlaciona-se com bons fatores prognósticos e sobrevida global em alguns tipos de câncer, incluindo câncer de mama. No entanto, pouco se sabe sobre como a localização subcelular de maspina é regulada. A maioria dos estudos sobre maspina é conduzido em linhagens de células tumorais, que apresentam uma grande variabilidade no contexto celular. Portanto, é importante usar uma linhagem celular não transformada para esta abordagem. Nesse trabalho investigamos fatores solúveis, interação célula-célula e interação célula-substrato como possíveis reguladores da localização de maspina na célula e as vias de sinalização envolvidas nesta regulação. Usando a linhagem celular epitelial mamária não transformada MCF10A como modelo, observamos por experimentos de imunofluorescência que o Fator de Crescimento Epidermal (EGF) promove a localização nuclear de maspina. EGF também altera a fosforilação da proteína conforme mostram nossos experimentos de 2D-SDS-PAGE e gel contendo Phostag. A fosforilação ocorre em resíduos de serina e a desfosforilação em resíduos de tirosina. À procura por vias de sinalização a jusante de do receptor de EGF envolvidas na regulação da localização subcelular de maspina, identificamos as vias de PI3K e Stat3 . Além disso, a adesão célula-célula parece bloquear a localização nuclear de maspina. Na tentativa de investigar funções celulares relacionadas à regulação de maspina por EGFR, identificamos proteínas que co-imunoprecipitam com maspina após o tratamento com EGF. O agrupamento funcional dessas proteínas sugere que a maspina pode estar envolvida em metabolismo de RNA, adesão celular e citoesqueleto. Desta forma, este trabalho identificou diferentes mecanismos que regulam a localização subcelular de maspina, que dependem da ativação das vias de PI3K e AKT pela via de EGFR.
Titre en anglais
Mechanisms of subcellular localization of maspin in breast epithelial cell line.
Mots-clés en anglais
EGFR
Maspin
Phosphorylation
Signaling
Subcellular localization
Resumé en anglais
Maspin, a 42 kDa tumor suppressor protein, belongs to the serpin (serine protease inhibitors) superfamily, however, its mechanism of action does not depend on protease inhibition. Maspin is expressed by epithelium of different organs and presents differential regulation during tumor progression. Among its biological activities, regulation of cell adhesion, migration, death, gene expression and oxidative stress response were described. Subcellular localization of maspin is related to the regulation of its biological functions. Recent clinical studies indicate that nuclear localization of maspin, not its expression levels, correlates with good prognostic factors and overall survival in some types of cancer, including breast cancer. However, little is known about how maspin subcellular localization is regulated. Most studies on maspin are conducted in tumor cell lines, which show great variability in cell context. Therefore, it is important to use a nontransformed cell line for this approach. Here we investigated soluble factors, cell-cell interaction and cell-substrate interaction as possible regulators of maspin subcellular localization and the signaling pathways involved. Using the MCF10A untransformed mammary epithelial cell line as a model system, we observed by immunofluorescence experiments that the Epidermal Growth Factor (EGF) promotes nuclear localization of maspin. EGF also alters the phosphorylation of the protein as observed by 2D-SDSPAGE and gel containing Phos-tag. Phosphorylation occurs on serine residues and dephosphorylation, on tyrosine residues. Looking for signaling pathways downstream of EGF receptor involved in regulation of maspin subcelular localization, we identified the PI3K and STAT3 pathways. On the other hand, cell-cell adhesion seems to block nuclear localization of maspin. In an attempt to investigate cellular functions related to regulation of maspin by EGFR, we identified proteins that co-immunoprecipitate with maspin in EGF-treated cells. The functional grouping of these proteins suggests that maspin may be involved with RNA metabolism, cell adhesion and cytoskeleton. Thus, this study identified different mechanisms that regulate subcellular localization of maspin, which depends on PI3K and STAT3 activation downstream of EGFR pathway.
 
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Date de Libération
2020-10-07
Date de Publication
2018-10-08
 
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