Melanoma é o mais letal tipo de câncer de pele e é originado a partir da transformação de melanócitos e várias alterações gênicas estão relacionadas a esse processo. Mutações e aumento no número de cópias de genes Ras é um dos mais importantes eventos, que ocorre em cerca de 91% dos casos de melanoma. Há vários efetores de Ras com potencial terapêutico. A família RASSF (Ras-association Family) é constituída por 10 membros (RASSF1-10), a maioria deles está relacionada a funções de supressores tumorais. RASSF9 é um membro do grupo N-terminal, que primeiramente foi descrito como P-CIP1, uma proteína envolvida no trafego de vesículas e foi demonstrada interagindo com Ras. A expressão de RASSF9 em camundongo é predominante no epitélio estratificado, onde é crucial para a homeostase tecidual. Além disso, a expressão de RASSF9 é maior em pessoas que tem uma maior exposição solar. Entretanto, não há informações sobre a função de RASSF9 em melanoma. Nós desenvolvemos uma linhagem de melanoma murino não metastática, Tm1.Luc, nocaute de RASSF9 com CRISPR/Cas9. Dados do TCGA demonstraram que RASSF9 está discretamente superexpressa em amostras de melanoma e que não há correlação entre o nível de expressão do mRNA e a fosforilação de seu promotor. Nós observamos uma redução na capacidade proliferativa in vitro e in vivo das células deficientes de RASSF9 que pode ser explicada pela supressão da via Ras/Raf/MERK/ERK, o que foi confirmado pro Western-Blot. Apesar da relevância de RASSF no processo de morte celular descrita em outros sistemas experimentais, nossos dados não permitem concluir, até o momento, se RASSF9 é capaz de modular significativamente esse processo celular em melanoma. Em resumo, nossos dados segurem que RASSF9 atua na regulação de Ras promovendo a proliferação de melanoma.

Melanoma is the most lethal skin cancer and is originated from melanocyte transformation. Several genetic changes are related to this process. Mutation or copy-number amplification of Ras is one of the most important events, which occurs in 91% of the cases. Therefore, regulators and/or partners of Ras could potentially be good drug targets for treatment. The Ras-association family (RASSF) comprises ten proteins (RASSF1-10), several of them are related to tumor suppression. RASSF9 is a member of N-terminal RASSF proteins and was first described as P-CIP1, a protein that is involved in vesicle trafficking, and has been shown to bind Ras proteins. In mice RASSF9 is predominantly expressed in the stratified epithelium, where it is crucial for epidermal homeostasis. Moreover, it was confirmed the RASSF9 gene is upregulated in samples of higher sun-exposure people. However, the function and importance of RASSF9 in melanoma is still obscure. Aiming to understand the role of RASSF9 in melanoma growth and metastasis, we have developed RASSF9-knockout TM1-luciferase cells by using CRISPR/Cas9 system. TCGA data analysis shows RASSF9 is upregulated in melanoma samples but without correlation between mRNA expression and promoter phosphorylation. We observed in RASSF9 knockout cells a reduction in proliferative capacity in vitro and in vivo that could be explained by suppression of Ras/Raf1/MEK/ERK pathway, as confirmed by Western-blot. Although previous evidence of the relevancy of RASSF members in cell death pathway, we were not able to conclude whether RASSF9 acts as a modulator in this cellular process in our experimental system. In summary, our results suggest that RASSF9 plays a role in Ras activation leading to proliferative capacity in melanoma cells.