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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.41.2014.tde-16012015-151748
Documento
Autor
Nome completo
Bruno Cesar Ribeiro Ramos
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2014
Orientador
Banca examinadora
Castrucci, Ana Maria de Lauro (Presidente)
Bianconcini, Marilene dos Santos Camponez
Fonseca, Silvia Carolina Guatimosim
Mimura, Olga Martins
Schumacher, Robert
Título em português
Fototransdução em células embrionárias ZEM-2S do peixe teleósteo Danio rerio
Palavras-chave em português
Dario rerio
Fototransdução
Melanopsina
Resumo em português
A melanopsina foi descoberta em 1998 por Ignacio Provencio e colaboradores em melanóforos de Xenopus leavis. Desde sua descoberta, esse fotopigmento surgiu como um possível candidato a intermediar os fenômenos de sincronização nos vertebrados. Nos mamíferos, a melanopsina é encontrada num pequeno subgrupo de células ganglionares da retina, conhecido como células ganglionares retinianas intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs) e o seu papel como fotopigmento responsável pela percepção luminosa, que leva à sincronização das espécies dessa classe aos ciclos de claro e escuro, já foi estabelecido. A melanopsina está presente na retina de todas as classes de vertebrados estudadas até o momento, mas, em contraposição a essa afirmação, a sua estrutura tem maior semelhança com opsina de invertebrados do que com opsina de vertebrados, sugerindo que sua fototransdução ocorra através da via dos fosfoinositídeos. Essa hipótese foi confirmada por diversos trabalhos na literatura e estudos posteriores demonstraram que, em vertebrados não mamíferos, a melanopsina é codificada por dois genes: um ortólogo ao de mamíferos, Opn4m, e um ortólogo ao de X. leavis, Opn4x, levantando diversas questões a respeito da funcionalidade dessa opsina. Nosso grupo vem estudando esse fotopigmento nos tecidos periféricos de vertebrados desde 2001, sendo que foi pioneiro em demonstrar, em melanóforos de Xenopus laevis, que a dispersão dos grânulos de melanina se dá através da fotoativação da melanopsina que desencadeia a cascata de fosfoinositídeos. E estudos mais recentes vêm colocando a melanopsina como um dos possíveis fotopigmentos responsáveis pela sincronização de relógios periféricos em organismos como peixes e anfíbios. Nesse sentido, a linhagem de células ZEM-2S do peixe teleósteo Danio rerio é um ótimo modelo para o estudo das vias de fototransdução em relógios periféricos. Já foi demonstrado que essa linhagem de células é responsiva a estímulos luminosos, exibindo uma proliferação diferencial frente a diferentes regimes de claro e escuro, e ativando a expressão de genes de relógio como clock, per1 e cry1b, que conhecidamente são responsáveis por sincronizar os ritmos biológicos ao fotoperíodo ambiental. Nossos experimentos de imunocitoquímica detectaram a presença das duas proteínas codificadas pelos genes opn4m-1 e opn4m-2 da melanopsina, e mostraram uma significativa diferença na distribuição das proteínas Opn4m-1 e Opn4m-2. Análises de PCR quantitativo mostraram que um pulso de luz azul de 10 min é capaz de alterar a expressão dos genes de relógio per1b, per2, cry1a e cry1b, e que essa alteração ocorre através da via dos fosfoinositídeos em células embrionárias ZEM-2S de Danio rerio. Em adição mostramos que para promover a alteração dos genes de relógio, a via dos fosfoinositídeos interage com outras vias de sinalização como a via do óxido nítrico (NO) e a via das proteína quinases ativadas por mitógenos (MAPKs). Esses dados sugerem que a melanopsina seja um dos principais candidatos a intermediar os processos de sincronização nessas células, pois a somatória dos resultados de detecção da melanopsina, estimulação dentro de seu espectro de absorção e ativação da via dos fosfoinositídeos, a coloca a frente de outras opsinas como vertebrate ancient opsin (Va-opsin) e teleost multiple tissue opsin (Tmt-opsin) e de outros candidatos como Crys fotossensíveis e mecanismos de estresse oxidativo. No curso deste trabalho também conseguimos definir metodologias eficientes de transfecção de RNA de interferência e de DNA plasmidial em células ZEM-2S de D. rerio, que são ferramentas fundamentais nos estudos de expressão gênica nesse modelo
Título em inglês
Phototransduction in embryonic ZEM-2S cells of the teleost fish Danio rerio
Palavras-chave em inglês
Danio rerio
Melanopsin
Phototransduction
Resumo em inglês
Melanopsin was discovered in 1998 by Ignacio Provencio and colleagues in Xenopus leavis melanophores. Since its discovery, this photopigment has emerged as a possible candidate to mediate synchronization in vertebrates. In mammals the melanopsin is found in a subset of retinal ganglion cells, known as intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs) and their role as the photopigment responsible for photoentrainment in mammals has already been established. Melanopsin is present in the retina of all vertebrate classes studied to date, nevertheless, its structure is more similar to invertebrate than to vertebrates opsins, suggesting that their phototransduction pathway occurs through the phosphoinositide pathway. This hypothesis has been confirmed by several studies in the literature. Later studies showed that melanopsin is encoded by two genes in non-mammalian vertebrates, Opn4m orthologous to mammalian and Opn4x orthologous to X. leavis, raising new questions about the functionality of this opsin. Our group has studied this photopigment in vertebrate peripheral tissues since 2001 and, in Xenopus laevis melanophores, we demonstrated that pigment granule dispersion occurs through photoactivation of melanopsin and triggering of phosphoinositide pathway. More recent studies have put melanopsin as a possible photoreceptor responsible for peripheral clocks entrainment in organisms like fish and amphibians. In this context, the ZEM-2S cell line of the teleost fish Danio rerio is a good model to study the mechanism of phototransduction in peripheral clocks. It has been previously demonstrated that this cell line is responsive to light stimuli, exhibiting a differential proliferation when submitted to different light/dark regimes and activating the expression of clock genes such as clock, per1 and cry1b, known to synchronize the biological rhythms to environmental photoperiod. Our immunocytochemistry experiments detected the presence of two proteins encoded by the melanopsin genes opn4m-1 and opn4m-2, and showed a significant difference in the distribution of proteins Opn4m-1 Opn4m-2. Quantitative PCR analyses showed that a 10-min blue light pulse is able to change the expression of the clock genes per1b, per2, cry1b and cry1a, and that this change occurred through the phosphoinositide cascade in embryonic ZEM-2S cells of D. rerio. In addition we showed that, to promote the change in clock gene expression, the phosphoinositide pathway interacts with other signaling pathways such as the nitric oxide (NO) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. These data suggest that melanopsin is a major candidate to mediate the photoentrainment in these cells, because taken together, the detection of melanopsin, stimulation within its absorption spectrum and activation of the phosphoinositide cascade, puts it ahead of other opsins, as the vertebrate ancient opsin (Va-opsin) and teleost multiple tissue opsin (Tmt-opsin), and other candidates, as photosensitive Crys and mechanisms of oxidative stress. In the course of this work, we could also define efficient methods for transfection of interference RNA and plasmidial DNA in ZEM-2S cells of D. rerio, which are fundamental tools in studies of gene expression in this model
 
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BrunoCesar_Ramos.pdf (2.98 Mbytes)
Data de Publicação
2015-02-20
 
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