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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.3.2007.tde-08012008-161633
Documento
Autor
Nome completo
Marilena Martins Pamboukian
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2007
Orientador
Banca examinadora
Tonso, Aldo (Presidente)
Augusto, Elisabeth de Fatima Pires
Schmidell Netto, Willibaldo
Título em português
Estudo da atividade respiratória de linhagens selvagens e transfectadas de células de insetos através de cultivos em biorreatores.
Palavras-chave em português
Biorreatores
Células de insetos
Drosophila melanogaster
Respiração celular
Spodoptera frugiperda
Resumo em português
A velocidade específica de respiração (QO2) é um parâmetro fundamental para entender-se o metabolismo e o estado fisiológico celular, fornecendo informações úteis para o processo e controle em biorreatores. Neste trabalho, cultivou-se diferentes células de insetos em ambiente controlado medindo-se o QO2 e concentração crítica de oxigênio (Ccrít). Foram utilizadas nos ensaios células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) não infectadas e células de Drosophila melanogaster (S2) selvagem e recombinantes, utilizadas na expressão de diferentes proteínas. Todas as experiências foram realizadas em biorreator Inceltech com volume de trabalho de 1L, mantido a temperatura de 28ºC, agitação de 100 rpm e oxigênio dissolvido (OD) a 40% da saturação de ar, com difusão por membrana de silicone com mistura gasosa (O2 e N2) e vazão gasosa constante. Foi utilizado meio de cultura Sf900II sem soro fetal bovino. O QO2 foi medido pelo método dinâmico e pelo balanço de oxigênio na fase líquida. Neste trabalho foi implementado um novo processo durante o método dinâmico para interromper completamente a transferência gasosa durante a execução deste método. Implementou-se também uma metodologia para medição de Ccrít. Chegou-se a concentrações máximas celulares (Xm), velocidades máximas específicas de respiração (QO2) na fase exponencial e Ccrít, conforme segue: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfectadas para expressão de GPV): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfectadas para expressão de EGFP): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfectadas para expressão de HBsAg): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. Conclui-se que as linhagens selvagens e transfectadas de S2 possuem entre si uma atividade respiratória diferente e também que as novas metodologias implantadas verificaram-se satisfatoriamente.
Título em inglês
Study of breathing activity of wild and transfected line of insect cells through cultivations in bioreactors.
Palavras-chave em inglês
Bioreactors
Cell respiration
Drosophila melanogaster
Insect cells
Spodoptera frugiperda
Resumo em inglês
Specific respiration rate (QO2) is a key parameter to understand cell metabolism and physiological state, providing useful information for process supervision and control. In this work, we cultivated different insect cells in a very controlled environment, being able to measure QO2 and critical oxygen concentration (Ccrit). Wild Spodoptera frugiperda (Sf9) and wild and transfected Drosophila melanogaster S2 cells (able to produce different proteins) were used. All experiments were performed in 1-liter working volume Inceltech bioreactor, maintaining temperature controlled at 28ºC, agitation rate at 100 rpm, and dissolved oxygen (DO) at 40% of air saturation, through membrane diffusion of mixed gases (O2 and N2) at constant total flow rate. SF900II serum free medium was used. QO2 was measured through dynamic method and oxygen mass balance in the liquid phase. In this work a new process was implemented during the dynamic method to interrupt completely the oxygen transfer during the execution of this method. It was also implemented a methodology for measurement of Ccrít (determined when DO reduces its decay rate, without oxygen transfer). Maximum cell concentration (Xm), maximum specific respiration rate (QO2) in the exponential phase and Ccrít were reached, as follows: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfected for GPV expression): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfected for EGFP expression): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfected for HbsAg expression): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. From these results, it can be concluded that the studied cell lines have different respiration activity and the new developed methodologies behave satisfactorily.
 
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Data de Publicação
2009-01-09
 
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  • Moraes AM, et al. Drosophila melanogaster S2 cells for expression of heterologous genes: From gene cloning to bioprocess development [doi:10.1016/j.biotechadv.2011.10.009]. Biotechnology Advances [online], 2012, vol. 01, p. 10.
  • JORGE, S. A. C., et al. Drosophila melanogaster S2 cells for expression of heterologous genes: From gene cloning to bioprocess development [doi:10.1016/j.biotechadv.2011.10.009]. Biotechnology Advances [online], 2012, vol. 30, p. 613-628.
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  • PEDRO, M. D. L., et al. Estudo comparativo dos métodos de transferência de oxigênio em culturas de células de inseto. In XVI SINAFERM - Simpósio Nacional de Bioprocessos, Curitiba, PR, 2007. Anais em CD-ROM (apresentação oral)., 2007.
  • Ventini DC, et al. Development of a bioprocess in bioreactor with S2 cells and downstream studies to scale up the production of Rabies Virus Glycoprotein. In Anual Meeting - Instituto Butantan, São Paulo, SP, 2008. Anais do Instituto Butantan - Anual Meeting 2008., 2008. Abstract.
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