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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.25.2016.tde-26022016-143429
Document
Auteur
Nom complet
Raquel Zanin Midena
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Bauru, 2015
Directeur
Jury
Andrade, Flaviana Bombarda de (Président)
Duarte, Marco Antonio Hungaro
Faria, Flavio Augusto Cardoso de
Gavini, Giulio
Stipp, Rafael Nobrega
Titre en portugais
Suscetibilidade antimicrobiana e protocolo de purificação de RNA para análise de expressão gênica de isolados clínicos de Fusobacterium nucleatum
Mots-clés en portugais
Fusobacterium nucleatum
Antibiótico
PCR em tempo real
Resumé en portugais
Fusobacterium nucleatum é uma espécie bacteriana Gram-negativa, anaeróbia estrita e uma das espécies frequentemente encontradas nas infecções primárias do sistema de canais radiculares. Esta espécie tem grande importância na formação de biofilmes por ser uma ponte de união entre espécies que não são capazes de interagir. Os micro-organismos constituintes de biofilmes trocam material genético, aumentando a tolerancia dos mesmos e é quase impossível um isolado clínico ter os genes totalmente iguais à cepa padrão de coleções de cultura como da ATCC (American Type Culture Colection). O presente estudo investigou a espécie bacteriana anaeróbia Fusobacterium nucleatum isolada de canais radiculares, comparando-a com sua cepa de referência. Foi feito a comparação da suscetibilidade microbiana in vitro por meio de cultura microbiológica pelo método do E-test, com as cepas em crescimento planctônico e em biofilme. Também foi definido um protocolo de Purificação de RNA para esta espécie em ambas as condições de crescimento. As cepas clínicas de F. nucelatum foram isoladas por meio da cultura microbiológica de 23 pacientes que apresentavam dentes com infecção primária e periodontite apical visível em radiografia. Foi feito isolamento e identificação da espécie por série bioquímica com testes comerciais (Sistema Api, Bio-Meriéux, França) e PCR convencional, sendo no total 4 isolados clínicos investigados. Foi verificada a suscetibilidade antimicrobiana dos seguintes antibióticos: Amoxicilina, Amoxicilina + ácido clavulânico, Ampicilina, Azitromicina, Clindamicina, Eritromicina e Metronidazol. O protocolo para purificação de RNA foi feito com microesferas de zircônia, dispositivo bead beater, kit comercial RNeasy (Qiagen) e transcrição para DNA complementar (cDNA). A qualidade da purificação foi testada quanto a sua capacidade de amplificação pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) utilizando primer para o gene 16s RNA específico para F. nucelatum. Todas as cepas testadas foram 100% suscetíveis a Amoxicilina + ácido clavulânico, Ampicilina, Azitromicina, Clindamicina e Metronidazol. Ambos os tipos de crescimento bacteriano demonstraram resistência somente à eritromicina. O protocolo proposto para a purificação do RNA de F. nucelatum dos isolados em crescimento planctônico e em biofilme foi eficaz. A média do rendimento do RNA das amostras para as bactérias em crescimento planctônico foi de 514,2 ng/μL (DP ± 397,7) e para as amostras em biofilme foi de 377,1 ng/μL (DP± 144,1). Os valores encontrados sugerem uma boa qualidade de RNA, livre de contaminação por proteínas. Todas as cepas de Fusobacterium nucleatum isoladas de canais radiculares, assim como a cepa ATCC foram suscetíveis aos antibióticos testados, com exceção do antibiótico eritromicina em ambos os tipos de crescimento bacteriano. As bactérias em biofilme apresentaram aumento na tolerância frente aos agentes antimicrobianos, com diferença estatística. O protocolo estabelecido para a purificação do RNA de cepas de Fusobacterium nucleatum cultivadas em fase planctônica e em biofilmes teve êxito com amplificação por qPCR.
Titre en anglais
Antimicrobial susceptibility and RNA purification protocol for gene expression analysis of clinical isolates of Fusobacterium nucleatum
Mots-clés en anglais
Fusobacterium nucleatum
Antibiotic
Real Time PCR
Resumé en anglais
Fusobacterium nucleatum is a Gram-negative bacterial species, strict anaerobic and one of the species often found in primary infection of the root canal system. This species has great importance in biofilm formation to be a union bridge between species which are not able to act alone. The constituent microorganisms of the biofilm exchange each tother genetic material, increasing the strength of them. It is almost impossible for a clinical isolate have genes totally equal to a standard strain, such as strains of culture collections like ATCC (American Type Culture Collection). The present study investigated anaerobic bacterial species Fusobacterium nucleatum isolated from root canals, comparing them to the ATCC strain. The microbial in vitro susceptibility of biofilm and planktonic growth of the strains was compared by means of microbiological culture and the E-test method, with the antibiotics Amoxicillin, Amoxicillin + clavulanic acid, Ampicillin, Azithromycin, Clindamycin, Eritromycin and Metronidazole.. Also, a RNA Purification protocol for the strains under the same growth conditions was defined. Clinical isolates were obtained by microbiological samples of patients with teeth with pulp necrosis and apical periodontitis visible on radiographs. The species isolation and identification were performed using commercial biochemical tests (Sistema Api, Bio-Meriéux, France) and conventional PCR, obtaining four clinical isolates. The protocol for RNA purification was done with zirconia beads, bead beater device and commercial kit RNeasy (Qiagen) and transcribed into complementary DNA (cDNA). The quality of purification was tested for its ability of amplification by real time polymerase chain reaction (qPCR) using primer for the gene 16s RNA specific for F. nucleatum. All tested trains were 100% susceptible to amoxicillin + clavulanic acid, ampicillin, azithromycin, clindamycin and metronidazole. Both types of bacterial growth showed resistance to Erythromycin. Bacteria in biofilm showed a decrease in susceptibility to all antibiotics, but without statistical difference. The protocol proposed for the purification of RNA of F. nucleatum was effective, in the planktonic and the biofilm growth. The average yield of RNA samples for bacteria in planktonic growth was 514.2 ng /μL (SD ± 397.7) and the samples in biofilm was 377.1 ng / μL (SD ± 144.1). These found values suggest a good quality of RNA, free of protein contamination. The established protocol for the purification of the RNA of the Fusobacterium nucleatum strains, grown in biofilm and planktonic phase, had successfully amplified by qPCR.
 
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Date de Publication
2016-02-29
 
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