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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.17.2019.tde-08012019-151743
Document
Author
Full name
Bárbara Cristina Martins Fernandes Paes
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2018
Supervisor
Committee
Castro, Virgínia Picanço e (President)
Cunha, Anderson Ferreira da
Panepucci, Rodrigo Alexandre
Reis, Luiza Cunha Junqueira
Title in Portuguese
Geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas e progenitores eritroides a partir de células-tronco de pluripotência induzida derivadas de pacientes com anemia falciforme
Keywords in Portuguese
Diferenciação hematopoética ; iPSC ; Diferenciação eritroide ; In vitro ; Anemia falciforme
Abstract in Portuguese
As células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) são células geradas a partir da reprogramação de células somáticas e têm potencial para diferenciação em todos os tipos celulares do organismo adulto. A indução da diferenciação de iPSC pacienteespecífico em células hematopoéticas é uma forma de estudo da hematopoese em modelos de doenças, como a anemia falciforme, e também essencial para o desenvolvimento de terapias. O presente estudo propôs a geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas e progenitores eritroides in vitro a partir de iPSC derivadas de pacientes com anemia falciforme através da formação de corpos embrioides. Ao longo da diferenciação, os desenvolvimentos hematopoético e eritroide foram monitorados através de ensaios de formação de colônia e imunofenotipagem por citometria de fluxo. Neste estudo, demonstramos a presença de células com fenótipo de células endoteliais no início da diferenciação hematopoética por formação de corpos embrioides, possivelmente indicando que as células progenitoras hematopoéticas são provenientes de um endotélio hemogênico. Também verificamos a presença de células endoteliais sem potencial de endotélio hemogênico. Geramos células com características de células-tronco/progenitoras hematopoéticas, de fenótipos CD34+CD45+ e CD45+CD43+, progenitores eritroides (CD36+, CD71+ e CD235a+), bem como a formação de colônias hematopoéticas em cultura em meio semi-sólido. A linhagem de iPSC PBscd08 demonstrou maior potencial para diferenciação em células hematopoéticas e eritroide que as demais linhagens celulares avaliadas. A linhagem PBscd01, também gerada a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de paciente com anemia falciforme, não demonstrou o mesmo potencial para a diferenciação hematopoética, gerando apenas células CD34+ e baixa porcentagem de células CD45+ e CD43+. A linhagem de iPSC PB12, gerada a partir de PBMC de indivíduo saudável, promoveu a geração de populações de células CD34+, CD45+ e CD43+, mas não duplo-positivas, e a geração de células com morfologia de células mieloides após a maturação. As linhagens celulares de iPSC demonstraram variabilidade quanto ao potencial de diferenciação hematopoética. Isto monstra a necessidade de estudos futuros para uma investigação mais detalhada.
Title in English
Generation of hematopoietic stem/progenitor cells and erythroid progenitor cells from induced pluripotent stem cells derived from patients with sickle cell anemia
Keywords in English
Hematopoietic differentiation ; iPSC ; Erythroid differentiation ; In vitro ; Sickle cell anemia
Abstract in English
Induced pluripotent stem cells (iPSC) are cells generated by reprogramming somatic cells, they have the potential for differentiation into all types of cells in the adult organism. The differentiation of patient-specific iPSC into hematopoietic cells is a way of studying hematopoiesis in disease models, such as sickle cell anemia, and is also essential for the development of therapies. The present study proposed the generation of hematopoietic stem/progenitor cells and erythroid progenitors from iPSC derived from patients with sickle cell anemia. Throughout the differentiation, hematopoietic and erythroid developments were monitored by colony forming cell assay and immunophenotypic analysis. In this study, we demonstrated the presence of cells with endothelial phenotype at the beginning of hematopoietic differentiation by formation of embryoid bodies, possibly showing that hematopoietic progenitor cells originate from a hemogenic endothelium. We generated cells with characteristics of hematopoietic stem/progenitor cells, of CD34+CD45+ and CD45+CD43+ phenotypes, erythroid progenitors (CD36+, CD71+ and CD235a+), as well as the formation of hematopoietic colonies in culture in semi-solid medium. The iPSC line PBscd08 demonstrated greater potential for differentiation into hematopoietic and erythroid cells than the other cell lines evaluated. The iPSC line PBscd01, also generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with sickle cell anemia, did not demonstrate the same potential for hematopoietic differentiation, generating only CD34+ cells and a low percentage of CD45+ and CD43+ cells. The iPSC line PB12, generated from healthy individual PBMC, promoted the generation of CD34+, CD45+ and CD43+ cell populations, but not double-positives, and the generation of cells with myeloid cell morphology after maturation. The iPSC cell lines demonstrated variability in the potential for hematopoietic differentiation. This shows the need for future studies for a more detailed investigation.
 
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Publishing Date
2019-02-15
 
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