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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.17.2018.tde-17042018-135821
Documento
Autor
Nome completo
Gabriela Pagano de Oliveira Gonçalves da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2017
Orientador
Banca examinadora
Frade, Marco Andrey Cipriani (Presidente)
Foss, Norma Tiraboschi
Rosa, Patrícia Sammarco
Título em português
Estudo comparativo entre teste rápido imunológico (LID-NDO) e PCR tempo real de raspado dérmico em álcool e em papel-filtro na hanseníase
Palavras-chave em português
Diagnóstico
ELISA antiPGL1
Hanseníase
PCR
Teste sorológico
Resumo em português
A hanseníase é uma doença infecciosa que acomete pele e nervos periféricos. Seu diagnóstico é baseado eminentemente nos seus aspectos clínicos variáveis e poucos são os exames complementares que auxiliam no diagnóstico, como baciloscopia do raspado intradérmico, histopatologia, ELISA anti- PGL1 (APGL1) e anti-LID, geralmente positivos nas formas multibacilares, dificultando o diagnóstico das formas paucibacilares. Busca-se comparar os resultados obtidos com o teste rápido imunológico (LID-NDO) Orange Life® com os resultados da PCR tempo real realizada nas amostras de raspado intradérmico e os resultados do ELISA APGL1 coletadas durante a ação por demanda espontânea (Hanseníase Brasília 2014), além de comparar eficiência entre dois métodos diferentes de conservação destas amostras (papel-filtro x álcool). Foram coletadas 277 amostras de raspado dérmico de 50 pacientes clinicamente diagnosticados com hanseníase durante a ação. Na mesma ocasião, os indivíduos diagnosticados foram submetidos à coleta de sangue periférico para teste rápido sorológico (Orange Life®) e ELISA APGL1. A extração de DNA do raspado intradérmico, armazenado no álcool e no papel-filtro, foi realizada no Laboratório de Dermatologia do HC-FMRP-USP. A PCR em tempo real foi realizada usando par de primers específicos RLEP, e o master mix sybr greenPromega. Dos 50 pacientes diagnosticados clinicamente, 90% são multibacilares. Todos os testes, tanto o teste rápido sorológico como a PCR, apresentaram maior positividade nos pacientes multibacilares. O teste rápido sorológico foi positivo em 64,44% dos pacientes multibacilares e em 40% dos paucibacilares. A PCR nas amostras armazenadas no álcool foi positiva em 19,05% dos pacientes multibacilares e a PCR do papel-filtro em 17,78%; nenhuma PCR foi positiva em pacientes paucibacilares. O ELISA APGL foi positivo em 56% dos pacientes diagnosticados. Na PCR das amostras armazenadas no papel-filtro, o sítio de coleta com maior positividade foram os cotovelos (75%). A concordância entre o teste rápido sorológico e a PCR e a concordância entre o teste rápido e o ELISA APGL1 foram fair (suave). Já a concordância entre a PCR das amostras armazenadas no álcool e a PCR das amostras armazenadas no papel-filtro foi perfeita. Concluímos que o exame clínico é ainda essencial para o diagnóstico da hanseníase, principalmente das formas paucibacilares. Os métodos de armazenamento do material coletado por raspado intradérmico (papel-filtro x álcool) não interferiram no resultado final da PCR, portanto o armazenamento no papel-filtro pode ser feito preferencialmente, pois apresenta menor custo para a extração de DNA. O teste rápido sorológico e o ELISA anti-PGL1 têm baixa especificidade, porém podem ter outras aplicações, diferentes do diagnóstico da hanseníase.
Título em inglês
Comparative study between immunological rapid test (LID-NDO) and real-time PCR of dermal smear in alcohol and filter paper in leprosy
Palavras-chave em inglês
anti-PGL1 ELISA
Diagnosis
Leprosy
PCR
Serological test
Resumo em inglês
Leprosy is an infectious disease that affects skin and peripheral nerves. Leprosy diagnosis is mainly based on its variable clinical aspects and few complementary tests that aid in the diagnosis, such as bacilloscopy, histopathology, besides the antiPGL1 ELISA (APGL1) and anti-LID, all of which are generally positive in multibacillary forms, confirming the difficulty in diagnosis of paucibacillary patients. The aim of this study was to compare the results obtained with the Orange Life® Immunological Rapid Test (LID-NDO) with the real-time PCR results obtained in the intradermal scraping samples and the results of the ELISA APGL1, collected during the "Hanseníase" action in Brasília in January 2014, in addition to comparing efficiency between two different methods of preservation of these samples (filter paper x alcohol). A total of 277 dermal smear samples were collected from 50 patients clinically diagnosed with leprosy during the procedure. At the same time, the individuals diagnosed were submitted to peripheral blood collection for serological rapid test (Orange Life®) and ELISA APGL1. The extraction of DNA from intradermal scrapings, stored in alcohol and filter paper, was carried out at the Dermatology Laboratory of HC-FMRP-USP. Real-time PCR was performed using a pair of primers specific for the RLEP gene, and the master sybr green-Promega. From 50 patients diagnosed clinically, 90% are multibacillary. All tests, both the serological rapid test and the PCR, were more positive in multibacillary patients. The rapid serological test was positive in 64.44% of the multibacillary patients, and in 40% of the paucibacillary. The PCR in the samples stored in the alcohol was positive in 19.05% of the multibacillary patients and the PCR of the filter paper in 17.78%; PCR weren't positive in paucibacillary patients. ELISA APGL was positive in 56% (28) of the diagnosed patients. In the PCR of the samples stored in the filter paper, the collection site with the highest positivity was the elbows (75%). The agreement between the rapid serological test and the PCR and the agreement between the rapid test and the ELISA APGL1 were fair. The agreement between the PCR of the samples stored in the alcohol and the PCR of the samples stored on the filter paper was perfect. We conclude that the clinical examination is still essential for the diagnosis of leprosy, especially in paucibacillary forms. We also concluded that the methods of storing the material collected by intradermal scraping (filter paper x alcohol) do not interfere in the final result of the PCR, therefore the storage in the filter paper can be done preferentially because it presents a lower cost for the extraction of DNA. Rapid serological test and the anti-PGL1 ELISA have low specificity, but may have other different applications than the diagnosis of leprosy.
 
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Data de Publicação
2018-07-25
 
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