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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.17.2016.tde-05012016-091813
Documento
Autor
Nome completo
Marcela Cristina Corrêa de Freitas
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2015
Orientador
Banca examinadora
Covas, Dimas Tadeu (Presidente)
Augusto, Elisabeth de Fatima Pires
Castro, Virgínia Picanço e
Faça, Vitor Marcel
Russo, Elisa Maria de Sousa
Título em português
Clonagem e expressão do fator VII de coagulação sanguínea em linhagens celulares humanas
Palavras-chave em português
Fator VII
Linhagens celulares humanas
Proteína recombinante
Resumo em português
O Fator VII recombinante (FVIIr) tem sido a principal escolha terapêutica dos pacientes hemofílicos que desenvolvem inibidores contra os fatores VIII e IX utilizados como tratamento. Atualmente, o produto utilizado é produzido em células de camundongo (BHK-21), o qual oferece desvantagens considerando a complexidade das modificações pós-traducionais desta proteína e a inserção de glicosilações de origem murina altamente imunogênicas aos seres humanos. Dessa maneira a produção de proteínas para uso terapêutico em linhagens celulares humanas surge como uma alternativa promissora. Dentro desse contexto, o objetivo principal deste trabalho foi clonar e expressar o FVII de coagulação sanguínea em 3 linhagens celulares humanas (HepG2, Sk-Hep, HKB-11), compará-las com a linhagem murina BKH-21, e selecionar a melhor produtora da proteína recombinante. As células foram modificadas com o vetor lentiviral p1054-CIGWS, contendo os genes do FVII e do marcador GFP. Após a modificação das células foi observada uma eficiência de transdução de 80% nas células BHK-21-FVIIr, 73% nas células HepG2-FVIIr, 32% nas células HKB-11-FVIIr e 95% Sk-Hep-FVIIr. Análises da expressão gênica por PCR em Tempo Real mostraram que as três linhagens humanas modificadas apresentaram expressão do RNAm relativo ao FVIIr, sendo que a linhagem celular HepG2 foi a que teve maior expressão de FVIIr, seguida da Sk-Hep-1 e HKB-11. Quando submetidas ao tratamento com vitamina K por um período de 10 dias em cultura, a expressão do gene FVIIr foi semelhante para as três linhagens (HepG2: 164563 URE, HKB-11: 119122 URE e Sk-Hep: 124919 URE). O FVII é uma proteína que para sua ativação, possui como principal modificação pós traducional a -carboxilação vitamina K dependente, que ocorre por meio do ciclo da vitamina K com a participação de 3 enzimas, -carboxilase, VKORC1 e calumenina (inibidor). A expressão gênica dessas enzimas foi avaliada antes e após o tratamento com a vitamina K. Foi possível observar que houve um aumento nos níveis de RNAm nas células humanas tratadas com vitamina K, sugerindo que esta é capaz de ativar as enzimas do ciclo da -carboxilação. A cinética de crescimento celular em garrafas estáticas mostrou que a as células murinas BHK-21 modificadas possuem uma velocidade específica de crescimento 25% mais elevada que das células humanas. Contudo a cinética de produção das linhagens recombinantes mostrou que as células humanas produzem cerca de 3 vezes mais FVIIr do as células BHK-21. Devida a baixa produção de FVIIr na linhagem celular murina, e ao fato de que a linhagem humana HepG2 apresenta um perfil de crescimento extremamente lento, as linhagens recombinantes Sk-Hep-1-FVIIr e HKB-11-FVIIr foram selecionadas para ensaios de cultivo em suspensão utilizando microcarregadores em frascos spinners. Ao longo de 10 dias de cultivo as células HKB-11-FVIIr mostraram uma produção acumulada de 152 g de FVIIr, o que corresponde a 304 UI. As células Sk-Hep-1-FVIIr produziram cerca de 202,6 g de FVIIr, o que corresponde a 405,2 UI. Em suma, nossos dados comprovam que as linhagens celulares humanas são eficazes para a produção de fator VII recombinante, uma vez que, utilizando nosso modelo de produção, estas mostraram-se melhores do que a de células murinas (BHK-21) utilizadas pela indústria. Assim, estas linhagens celulares humanas podem ser usadas como uma nova plataforma para a produção de FVII, bem como para outras proteínas recombinantes, de maneira mais segura e com menor risco de desenvolvimento de anticorpos inibidores
Título em inglês
Cloning and expression of coagulation factor VII in human cell lines
Palavras-chave em inglês
Factor VII
Human cells
Recombinant protein
Resumo em inglês
Recombinant factor VII (FVIIr) has been the main therapeutic choice for hemophilic patients who develop inhibitors antibidies to conventional treatments (FVIII and FIX). Currently, the comercial product is produced in murine cells (BHK-21) which gives disadvantages considering the complexity of post-translational modifications of these proteins. The insertion of murine residues can be highly immunogenic in humans. Thus the production of proteins for therapeutic use in human cell lines appears as a promising alternative. In this context, the aim of this study was to clone and express the blood coagulation FVII in 3 human cell lines (HepG2, Sk-Hep-1, HKB-11) and select the best cell line for production of recombinant protein. The cells were modified with the lentiviral vector p1054-CIGWS containing the FVII gene and GFP gene marker. After cells modification we observed efficiency of transduction, in which 80% of BHK-21-FVIIr cells showed GFP expression, 73% of HepG2-FVIIr cells, 32% of HKB-11-FVIIr cells and 95% SK- Hep-FVIIr. Gene expression analysis by real-time PCR showed that the three modified human cell lines exhibited RNAm expression relative to FVIIr. When cells were treated with 5 ug/mL vitamin K in culture, the gene expression of FVIIr was similar in the three cell lines (HepG2: 164 563 URE, HKB-11: 119122 and SK-Hep URE: 124919 URE). For FVII activation, the main post translational modification is -carboxylation vitamin-K-dependent which envolves three enzymes, -carboxylase, VKORC1 and calumenina (inhibitor) . Gene expression of these enzymes was evaluated before and after treatment with vitamin K. It was observed that there was an increase in mRNA levels in human cells treated with vitamin K, suggesting that the treatment is capable of activating the enzymes of the vitamin K cycle. Cell growth kinetics showed that modified murine cells BHK-21 have a higher specific growth rate, around 25% more than human cells. However the kinetics of production of recombinant cell lines showed that human cells expressing rFVII 3-fold more rFVII than BHK-21 cells. Due the low rFVII production of murine cells, and the extremely slow growth profile of human cell line HepG2, the recombinant cell lines Sk-Hep-1-rFVII and HKB-11-rFVII have been selected for cultivation tests in suspension using microcarriers in spinners flasks. Over 10 days of cultivation the HKB-11 cells showed a cumulative production of rFVII 152 ug, corresponding to 304 IU and SK-Hep-1 cells showed a rFVII production of 202.6 ug, corresponding to 405.2 IU. In summary, our data demonstrate that human cell lines are effective for producing recombinant factor VII. Using our production model, human cells were better than murine cells (BHK-21) used by the industry. Thus, these human cell lines can be used as a new platform for the FVII production, as well as for other recombinant proteins, with less risk of developing inhibitor antibodies
 
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Data de Publicação
2016-01-11
 
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