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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.17.2018.tde-26042018-111713
Documento
Autor
Nome completo
Ronaldo Bragança Martins Junior
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2017
Orientador
Banca examinadora
Arruda Neto, Eurico de (Presidente)
Chahud, Fernando
Fonseca, Benedito Antonio Lopes da
Machado, Clarisse Martins
Watanabe, Aripuanã Sakurada Aranha
Título em português
Infecção por rinovírus em células linfoides de tonsilas humanas
Palavras-chave em português
Adenoide
Amígdala
Doença adenotonsilar crônica
Persistência
Rinovírus
Resumo em português
Rinovírus (RV) é freqüentemente detectado nos tecidos tonsilares e nas secreções de nasofaringe de pacientes com doença adenotonsilar crônica, sem sintomas de infecção respiratória aguda (IRA). O objetivo deste estudo foi investigar a infecção por rinovírus em tonsilas humanas, com base em dois aspectos: infecção in vivo de células linfóides de tonsilas humanas naturalmente infectadas; e infecção ex vivo de células dissociadas desses tecidos inoculadas com rinovírus, visando a contribuir para elucidar possíveis mecanismos de infecção em amígdalas palatinas e adenóides humanas. De um total de 104 pacientes com doenças adenotonsilar crônicas, 21.1% (22/104) e 42.3% (44/104) apresentaram respectivamente amígdalas palatinas e adenóides positivas para RV por PCR. A replicação viral foi confirmada por hibridização in situ com sonda para intermediário replicativo nas regiões internas e externas aos folículos linfóides de amígdalas e adenóides, bem como em porções do epitélio ciliado de adenoides, e apenas raramente nas células epiteliais escamosas de tonsilas palatinas. A presença e distribuição de proteína estrutural do capsídeo viral foi detectada por imunohistoquímica (IHQ), utilizando anticorpos contra proteínas estruturais virais VP1 e VP2 nas tonsilas positivas para RV por qPCR. Os resultados indicaram marcação positiva tanto na superfície (epitélio), quanto em regiões extrafoliculares e centros germinativos. Em seguida, foi possível verificar a co-localização da marcação positiva da proteína estrutural VP2 de RV com marcadores linfocitários de membrana. Células CD4 + e CD20 + apresentaram marcação positiva para VP2 verificada usando estratégia de 'sequential immuno-peroxidase labelling and erasing' (SIMPLE). Culturas primárias de células linfomononucleares (CLMN) de tonsilas sabidamente negativas para RV por PCR, foram infectadas in vitro, com RV (MOI=1). A replicação de RV foi titulada por TCID50, mostrando aumento inicial (24 h) e subsequente queda após 48 horas. Por IF observamos que os fenótipos de CLMN infectadas com RV in vitro foram células T CD4 + e B, mas também com células CD8 +, CD56 + e CD33 +. RV não infectou células CD123 +. RV foi isolado em WI- 38 e HeLa a partir de tecidos e secreções de nasofaringe de pacientes com hipertrofia tonsilar sem sintomas de infecção respiratória aguda. Nossos resultados confirmam que tonsilas de pacientes sem sintomas respiratórios agudos podem ser reservatórios de RV, que infecta não somente epitélio, mas também CLMN (frequentemente linfócitos T CD4 + e linfócitos B). A detecção de RNA intermediário replicativo e proteínas estruturais VP1 e VP2 nas tonsilas hipertróficas, além do isolamento de vírus infeccioso a partir de tecidos e secreções nasofaríngeas, classificam tonsilas hipertróficas como sítios de infecção e replicação de RV, e sugerem que esses indivíduos hipertróficos são portadores assintomáticos de RV persistente, e podem ser importantes fontes de transmissão de RV na comunidade.
Título em inglês
Rhinovirus infection in lymphoid tissues from hypertrophic human tonsils
Palavras-chave em inglês
Adenoid
Chronic adenotonsillar disease
Persistence
Rhinovirus
Tonsil
Resumo em inglês
The chronic adenotonsillar diseases are frequent otorhinolaryngologic conditions caused by chronic inflammation of adenoids and palatine tonsils. Rhinovirus (RV) is highly frequently detected in secretions, and tonsillar tissues from patients experience chronic tonsillar hypertrophy without symptoms of ARI, and our goal is to full understanding of viral infections in hypertrophic tonsillar tissues by RV. Of 104 enrolled patients with adenotonsillar chronic diseases, 21.1% (22/104) and 42.3% (44/104) had palatine tonsils and adenoids positive for RV by qPCR, respectively. RV Viral replication was confirmed by in situ hybridizations. Minus-strand RNA were detected in all tested samples (7 tonsils and 9 adenoids), and positive reactions were seen inside and outside of lymphoid follicles from tonsils and adenoids, in the ciliated epithelium of the adenoids and rarely in positive squamous epithelium cells from tonsils. The presence of viral structural protein VP1 and VP2 was detected within and outside of the lymphoid follicles from tonsils and adenoids, and also in epithelial cells from adenoids by immunohistochemistry (IHC). Later, by sequential immuno-peroxidase labelling and erasing protocol (SIMPLE), we saw co-localization of RV VP2 capsid protein staining with CD4 positive cells and CD20 positive cells. We confirmed that RV could infect primary culture of tonsilar mononuclear cells (TMNCs). Additionally, intracellular replication of RV in TMNCs, measured by TCID50 in HeLa cells, had an initial increase in the first 24 hours, and dropped at 48 hours post infection. Immunolocalization staining with anti-RV and TMNCs surface markers indicated that phenotypes of susceptible cells were T-cells both CD4+ and CD20+, but also, we saw co-localization of VP-2 protein with CD8+ cells, CD56+ cells and CD33+ cells. RV-16 couldn't infect CD123+ cell in our experiments. Finally, we were able to recover 4 rhinoviruses by inoculating WI-38 fibroblast cells and HeLa cells, confirming by the cytopathic effect and immunofluorescence positive staining with anti-VP1 antibody. Taken together, our results indicate that tonsils and adenoids of patients without ARI may be reservoirs of replicating human rhinovirus, infecting manly Tcells CD4+ and CD20+ B-cells. The high-frequency detection of RNA (-) and VP1 expression in tissues from patients with chronic adenotonsillar diseases, plus the isolation of infectious viral particles, suggests that these detected agents replicate in the adenotonsillar tissues and this specific sites may be important sources of transmission of RV in the community.
 
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Data de Publicação
2018-07-19
 
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