A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada pela perda progressiva de memória episódica relacionada à agregação do peptídeo ?-amiloide (A?) e à fosforilação anormal da proteína tau, levando à perda da função colinérgica. É bem conhecido que o comprometimento desta função devido à neurotoxicidade do peptídeo A? contribui significativamente para o declínio cognitivo associado à DA. Os inibidores da enzima acetilcolinesterase (AChE) compõem a principal classe de drogas usadas no tratamento da DA. No entanto, há uma grande necessidade de síntese de novas moléculas, uma vez que os fármacos já em uso pelos pacientes apresentam alta toxicidade hepática, além de vários efeitos colaterais devido à ação nos tecidos periféricos. A hipótese do presente projeto se baseia na atividade de indução de neurodiferenciação e neuritogênese de novos compostos inibidores de AChE, os quais são híbridos sintéticos de donepezila-tacrina, além de atuarem como neuroprotetores em culturas de células neuronais, sob condições experimentais de um estímulo neurotóxico e de estresse oxidativo induzidos pelo peptídeo A?(1-42) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de neurodiferenciação e neuritogênese, assim como o potencial neuroprotetor de duas moléculas híbridas de donepezila-tacrina na linhagem SH-SY5Y, modelo de diferenciação neuronal. Foram realizados ensaios de citotoxicidade e hepatotoxicidade em células tratadas e coletadas em diferentes tempos (24, 48, 72 e 120 h) nas linhagens celulares SH-SY5Y e HepG2, respectivamente. Ensaios de diferenciação neuronal (análise morfológica), expressão proteica, cinética ciclo celular, proliferação celular, alterações mitocondriais e de estresse oxidativo foram realizados em linhagem neuronal SH-SY5Y. Ainda, foram realizados ensaios de viabilidade e morte celular para avaliar a capacidade de neuroproteção dos novos compostos híbridos na linhagem SH-SY5Y. Estes não se mostraram citotóxicos e não alteraram a viabilidade celular em todas as concentrações avaliadas: TA8Amino 0,0035 a 0,112µM e TAHB3 0,088 a 2,84µM; nos ensaios de hepatotoxicidade, o composto TAHB3 reduziu a viabilidade celular na maior concentração (2,84 µM) e no tempo de 24 h. Ambos os compostos híbridos foram capazes de induzir diferenciação neuronal e neuritogênese, cerca de 55% das células para TA8Amino e 43% para TAHB3. Apenas o composto TA8Amino induziu um aumento de aproximadamente 75% na expressão do marcador ?-III-Tubulina comprovando a formação de neurônios maduros. Nenhum dos tratamentos realizados causaram alterações significativas na distribuição das células nas fases do ciclo celular e no ensaio de proliferação celular. O composto TA8Amino foi capaz de induzir a produção de ROS intracelular (48,27%) e mitocondrial (67,60%) nas células diferenciadas. Ambos os compostos híbridos aumentaram a expressão de SOD1, indicando atuação na atividade antioxidante das células. Entretanto, os compostos não alteraram o potencial de membrana mitocondrial e massa mitocondrial. Esses dados demonstram que o estresse oxidativo induzido pelo TA8Amino não gerou danos por disfunção mitocondrial nas células diferenciadas. Na avaliação de alterações da expressão proteica de PTEN(Ser380/Thr382/383), AKT(Ser473) e COX2 ambos os compostos híbridos promoveram a indução de PTEN e AKT. TA8Amino e TAHB3 induziram um aumento na expressão de COX2 demonstrando umapossível atuação na via de sinalização PI3K/AKT/COX2, compatível com a diferenciação neuronal. Nos ensaios de viabilidade celular, os compostos TA8amino e TAHB3 apresentaram efeito de neuroproteção frente ao dano neurotóxico induzido pelo peptídeo A?(1-42), promovendo uma proteção de 91,93% para TA8Amino e 54,68% para TAHB3, embora o mesmo efeito não tenha sido observado nas células tratadas com o peróxido de hidrogênio. Entretanto, a indução de morte por apoptose pelas moléculas híbridas nas células tratadas com o peptídeo A?(1-42) foi apenas levemente alterada pelos compostos, havendo uma redução de 5,10 e 4,85%, respectivamente, para TA8Amino e TAHB3. Em geral, os resultados do presente trabalho demonstraram que os compostos híbridos donepezilatacrina (TA8amino e TAHB3), inibidores da AChE, apresentam vantagens como potenciais fármacos, visto não serem citotóxicos nas concentrações de inibição da enzima AChE, além de serem capazes de induzir diferenciação neuronal, neuritogênese e neuroproteção, diferentemente dos fármacos donepezila e tacrina, testados isoladamente.

Alzheimer's disease (AD) is characterized by a progressive loss of episodic memory related to aggregation of ?-amyloid peptide (A?) and to abnormal phosphorylation of tau protein, leading to loss of cholinergic function. It is well known that the impairment of this function due to A? peptide neurotoxicity contributes significantly to the cognitive decline associated with AD. Acetylcholinesterase (AChE) inhibitors are the main class of drugs used to treat AD. However, there is a great need for synthesis of new molecules, since current drug treatment presents high hepatic toxicity, besides several side effects due to the action in the peripheral tissues. The hypothesis of this project is based on the activity of AChE inhibitor compounds (synthetic hybrids of donepezil-tacrine) in terms of inducing neurodifferentiation and neuritogenesis, as well as neuroprotective effects in neuronal cells under experimental conditions of a neurotoxic stimulus and oxidative stress induced by the peptide A? (1-42) and hydrogen peroxide (H2O2). Thus, the objective of this work was to evaluate the neurodifferentiation and neuritogenesis abilities, as well as the neuroprotective potential of two hybrid molecules of donepezil-tacrine in the SH-SY5Y model. Cytotoxicity and hepatotoxicity assays were performed on treated cells that were collected at different times (24, 48, 72 and 120 h) in SH-SY5Y and HepG2 cell lines, respectively. Neuronal differentiation assays (morphological analysis), protein expression, cell cycle kinetics, cell proliferation, mitochondrial changes and oxidative stress were performed on SH-SY5Y cell line. Further, viability and cell death assays were performed to evaluate the neuroprotection ability of the novel hybrid compounds in SH-SY5Y cells. The compounds did not present cytotoxic effects and did not alter cell viability at the following concentrations: TA8Amino 0.0035 to 0.112?M and TAHB3 0.088 to 2.84?M; in the hepatotoxicity assays, TAHB3 reduced cell viability only at the highest concentration (2.84 ?M) and at the time of 24 h. Both hybrid compounds were able to induce neuronal differentiation and neuritogenesis, around 55% after TA8Amino and 43% after TAHB3 treatment. Only TA8Amino induced approximately 75% increase in ?-III-Tubulin expression, compatible with the formation of mature neurons. None of the treatments performed caused significant changes in cell cycle kinetics. The synthetic hybrid TA8Amino induced the production of intracellular (48.27%) and mitochondrial ROS (67.60%). Both hybrid compounds increased SOD1 expression, which could be related to the increase of oxidative damage. However, both TA8amino and TAHB3 did not promote changes in mitochondrial membrane and mitochondrial mass potential. This data demonstrate that oxidative stress induced by TA8Amino did not generate damage due to mitochondrial dysfunction in differentiated cells. In the evaluation of changes in PTEN(Ser380/ Thr382/383), AKT(Ser473) and COX2 protein expression, both hybrid compounds were able to induce PTEN and AKT expression. TA8Amino and TAHB3 promoted an increase in COX2expression indicating a possible role in the PI3K/AKT/COX2 pathway, which is related to neuronal differentiation. In the cell viability assays, TA8amino and TAHB3 showed a neuroprotective effect against the neurotoxic damage induced by the A? peptide (1-42), promoting a protection of 91.93% for TA8Amino and 54.68% for TAHB3, although the same effect could not be observed in cells treated with hydrogen peroxide. However, the induction of apoptosis by the hybrid molecules in cells treated with the A?(1-42) peptide was only slightly altered by the compounds, with a reduction of 5.10 and 4.85%, respectively, for TA8Amino and TAHB3, respectively. In general, the results of the present work demonstrate that donepezil-tacrine hybrid compounds (TA8amino e TAHB3), AChE inhibitors, have advantages as potential drugs, since they are not cytotoxic at concentration levels that inhibit AChE enzyme, besides being able to induce neuronal differentiation, neuritogenesis and neuroprotection, unlike the drugs donepezil and tacrine, tested alone.