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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.17.2014.tde-21052014-114756
Documento
Autor
Nome completo
Liliane Maria Fróes de Macedo
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2014
Orientador
Banca examinadora
Simoes, Zila Luz Paulino (Presidente)
Bitondi, Marcia Maria Gentile
Dallacqua, Rodrigo Pires
Lourenço, Anete Pedro
Silva, Carlos Gustavo Nunes da
Título em português
Análise do Processo de Ativação dos Ovários de Apis mellifera, Aspectos Morfológicos e Expressão Gênica
Palavras-chave em português
Apis mellifera
MicroRNAs
Patência
Reprodução
RNA-seq
Resumo em português
Inúmeros aspectos da reprodução em Apis mellifera já foram extensamente divulgados, no entanto, os mecanismos reguladores da manutenção do estado estéril das operárias, bem como aqueles que permitem a ativação de seus ovários, ainda estão para serem descobertos. Por exemplo, a organização dos folículos ovarianos em crescimento e a arquitetura e papel das células foliculares neste processo. Além disso, para compreender o processo de ativação dos ovários em um contexto mais amplo, também é necessária uma investigação da síntese e maturação de diferentes classes de RNAs as quais modelam redes de interações gênicas extremamente complexas. Portanto, neste doutorado, tivemos como objetivo realizar 1- uma análise morfológica dos ovários ativos de operárias de A. mellifera obtidos em condições orfandade, com ênfase nas células foliculares e 2- um estudo aprofundado da regulação da expressão gênica (genes estruturais e reguladores) que é de fundamental importância para ligar os genótipos aos fenótipos. A análise morfológica dos ovários de operárias de A. mellifera foi realizada em microscópio de fluorescência ou confocal (priorizou a contagem das células foliculares) e microscópio eletrônico de transmissão, que permitiu a descrição e caracterização, pela primeira vez, da patência em ovários de operárias A. mellifera. Paralelamente, por meio da técnica de RNAseq, foi possível analisar o transcriptoma (miRNAs e mRNAs) de amostras específicas de ovários, em diferentes estados fisiológicos, em rainhas e operárias. Os mRNAs e miRNAs que se destacaram em nossas análises in silico foram validados experimentalmente por RT-PCR com alto grau de reprodutibilidade e em harmonia com o estado fisiológico dos ovários. Os transcritos altamente expressos nos ovários ativados foram: fpps5, cad, obp7, yellow-g e aqueles representados pelo GB42182 e GB44975. Acreditamos estes genes possam fazer parte da rede que regula o processo de ativação dos ovários em A. mellifera. Os miRNAs que se destacaram em nossas análises foram: A) miR-306 e miR-317 - altamente expressos nas amostras de ovários funcionais e B) miR-71 pelo fato de, nas análises in silico, ser o mais forte candidato a alvejar a vitelogenina, e na análise experimental, apresentarem, microRNAs e mRNAs, perfis de expressão antagônicos. A construção de bibliotecas de microRNAs e mRNAs a partir de ovários funcionais e não funcionais de abelhas operárias e rainhas, a análise de expressão, bem como a predição de uma rede de integração nos deu um retrato do sensível equilíbrio reprodutivo que mantém ambas as castas em aparente harmonia dentro da colônia aonde elas assumem, no momento certo, seus papéis nesta sofisticada sociedade empreendendo ou não a reprodução.
Título em inglês
Analysis of the Activation Process of Ovaries in Apis mellifera, the Morphological Aspects and Gene Expression
Palavras-chave em inglês
Apis mellifera
MicroRNAs
Patency
Reproduction
RNA-seq
Resumo em inglês
Countless aspects of reproduction in Apis mellifera have been widely published, however, the regulatory mechanisms for the maintenance of the sterile state of workers as well as those that allow the activation of their ovaries are still to be discovered, as much as the organization of growing ovarian follicles, the architecture and the role of follicular cells during this process. Furthermore, to understand the activation process of the ovaries in a broader context, it is also necessary to investigate the synthesis and maturation of different classes of RNAs which exemplify networks of gene interactions, extremely complex. Therefore, PhD project, we aimed to approach: 1 - A morphological analysis of active ovaries of A. mellifera workers obtained in queenless conditions, with emphasis on the follicular cells and 2 - A detailed study of the regulation of gene expression (structural and regulatory genes) that is crucial for linking genotypes to phenotypes. Morphologic analysis of workers ovaries of A. mellifera was performed under a fluorescence microscope or confocal (prioritized follicular cell count) and transmission electron microscope, which allowed, for the first time, a description and characterization of the patency of worker ovaries in A. mellifera. Similarly, by RNAseq technique, it was possible to analyze the transcriptome (miRNAs and mRNAs) of specific samples of ovaries at different physiological states, in queens and workers. mRNAs and miRNAs that stood out in our in silico analysis were experimentally validated by RT-PCR with high reproducibility and in harmony with ovaries physiologic state. Transcripts highly expressed in activated ovaries were fpps5, cad, obp7, yellow-g and those represented by GB42182 and GB44975. We believe these genes may be part of the network that regulates ovaries activation process in A. mellifera. miRNAs that stood out in our analysis were: - a) - miR-306 and miR-317 - highly expressed in samples of active ovaries and b) -miR-71 by the fact that the in silico analysis, was the strongest candidate to target vitellogenin, and in experimental analysis, presented antagonistic profile of expression when microRNAs and mRNAs were contrasted. The construction of microRNAs and mRNAs libraries from active and inactive ovaries of worker bees and queens, the analysis expression, as well as the prediction of a integrative network has given us a portrait of the sensitive reproductive balance that keeps both castes of bees in apparent harmony within the colony, where they take each one, at the right time, their roles in this sophisticated society, undertaking or not the reproduction.
 
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Data de Publicação
2015-05-29
 
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