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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.17.2008.tde-04042008-144240
Documento
Autor
Nome completo
Anete Pedro Lourenço
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2008
Orientador
Banca examinadora
Simoes, Zila Luz Paulino (Presidente)
Barchuk, Angel Roberto
Cendes, Iscia Teresinha Lopes
Daffre, Sirlei
Larson, Maria Luisa Paco
Título em português
Genes codificadores dos peptídeos antimicrobianos e de outras proteínas envolvidas na resposta imune de in Apis mellifera
Palavras-chave em português
Apis mellifera
Imunidade
Peptídeos antimicrobianos
Proteínas envolvidas na resposta imune
Resumo em português
Os insetos desenvolveram um sistema imune eficiente contra parasitas e patógenos, que compreende a resposta celular e a humoral. Os mecanismos celulares envolvem a fagocitose e a encapsulação pelos hemócitos, enquanto que as respostas humorais incluem a ativação da Profenoloxidase, e a síntese pelo corpo gorduroso dos peptídeos antimicrobianos, que são liberados na hemolinfa. Duas vias de sinalização intracelular, Toll e Imd, controlam a expressão dos genes codificadores dos peptídeos antimicrobianos. A análise do Genoma da abelha Apis mellifera permitiu a identificação dos genes dessas vias. No entanto, pouco se conhece do mecanismo de resposta imune nessas abelhas. Desta maneira, nos propusemos analisar a transcrição de genes efetores da resposta imune (abaecina, hymenoptaecina, defensina, transferrina, profenoloxidase), assim como os genes integrantes das vias de sinalização, tais como os genes de reconhecimento de microorganismos (PGRP, GNBP) e ainda, os de sinalização (cactus, relish, dorsal 1-B). Avaliamos também possíveis proteínas implicadas na resposta imune, como as proteínas de estocagem Vitelogenina, Hexamerina 70a, Lipoforina I/II e Lipoforina III. Finalmente, analisamos o efeito da nutrição e do envelhecimento sobre a imunidade em abelhas. Para análise da expressão dos genes das vias de sinalização, as abelhas foram infectadas com bactérias Serratia marcescens ou Micrococcus luteus por injeção ou via alimentação. A infecção com esses microorganismos provocou a transcrição de peptídeos antimicrobianos e de transferrina em altas quantidades após 3 e 12 horas de tratamento, além da alteração na quantidade de transcritos de outros genes. O papel dos genes profenoloxidase e dorsal na imunidade, descritos como codificadores de importantes proteínas em outros insetos, foi avaliado através da metodologia de silenciamento gênico por RNA de interferência. Observamos a diminuição da transcrição do gene alvo, mostrando a eficiência da metodologia. No entanto, a simples injeção de um RNA de fita dupla foi capaz de ativar o sistema imune de abelhas. Este efeito contribuiu para a dificuldade de atribuição do papel da Profenoloxidase na imunidade de abelhas. Contudo, os resultados de silenciamento de dorsal e suas isoformas, nos levaram a considerar que dorsal 1-A ou dorsal 2 participam da via de sinalização intracelular para produção de peptídeos antimicrobianos, principalmente de defensina. Em relação às proteínas de estocagem, tanto a quantidade de transcritos quanto de proteínas diminui após infecção com bactérias, indicando que estas proteínas estão envolvidas de alguma forma no processo de imunidade em abelhas. Além disso, consumo de alimentos ricos em proteína aumentou os níveis de transcritos das proteínas de estocagem, o que muito provavelmente favorece a manutenção da capacidade de resposta imune de abelhas. O efeito do envelhecimento no declínio da imunidade foi analisado em abelhas nutridoras (novas) e forrageiras (velhas) de uma colônia típica. Além disso, foram utilizadas abelhas de uma colônia single-cohort, que eram de uma mesma idade, mas algumas eram nutridoras, enquanto outras eram forrageiras. Todas as abelhas, independentemente da idade ou comportamento, foram capazes de ativar o sistema imune após infecção pela bactéria S. marcescens. No entanto, as abelhas com o comportamento de forrageira, independentemente da idade, sempre foram mais susceptíveis a infecções que as nutridoras. Este fato se deve, muito provavelmente, às diferenças fisiológicas entre essas abelhas, que proporciona às nutridoras maior competência à sobrevivência.
Título em inglês
Genes encoding antimicrobial peptides and immune-related proteins in Apis mellifera.
Palavras-chave em inglês
Antimicrobial peptides
Apis mellifera
Immune-related proteins
Immunity
Resumo em inglês
Insects have developed an efficient immune system against parasites and pathogens, which is comprised of both cellular and humoral responses. The cellular mechanisms involve phagocytosis and encapsulation by hemocytes, whereas the humoral responses include activation of prophenoloxidase and synthesis of antimicrobial peptides by the fat body, which are released into the hemolymph. Two signaling pathways, Toll and Imd, control the expression of genes encoding antimicrobial peptides. Genome-wide analyses of the honey bee, Apis mellifera, have identified predicted genes for these signaling pathways. However, immune response mechanisms in honey bees were not yet in depth studied. We analyzed the transcription of effector genes (abaecin, hymenoptaecin, defensin, transferin, prophenoloxidase), as well as other immune genes, such as pathogen recognition genes (PGRP, GNBP) and signaling genes (cactus, relish, dorsal 1- B). We also investigated the role of the storage proteins Vitellogenin, Hexamerin 70a, Lipophorin I/II and Lipophorin III in the honey bee immunity. Finally, we analyzed the effect of nutrition and aging on honey bee immunity. Gene expression of signaling pathway components was assessed in honey bees that had been infected with the bacteria Serratia marcescens or Micrococcus luteus through injection or oral challenge. Honey bees infected with these microorganisms had strong up-regulation of antimicrobial peptide genes and of transferin, and also other changes in transcript abundance after 3 and 12 hours of challenge. The roles of prophenoloxidase and dorsal in the immune response, described as genes encoding important proteins in other insects, were also investigated. In this case we used RNA interference (RNAi) to silence the expression of these genes. RNAi efficiently silenced the target genes. However, injection of doublestranded RNA in honey bees induced a reaction by the immune system. This made it difficult to determine the role of prophenoloxidase in honey bee immunity. Yet, silencing of dorsal and its isoforms led us to consider dorsal 1-A or dorsal 2 as members of the signaling pathways that produce antimicrobial peptides, especially defensin. The abundance of storage proteins transcripts and proteins was lower in infected bees than in controls, giving evidence that these proteins participate in the immune process in honey bees. Moreover, protein consumption caused up-regulation of genes encoding storage proteins, which may favor the maintenace of the immune response capacity. The effect of aging on decline in immunity was analyzed in (young) nurse bees and (old) foragers from normal free-flying colony. We also examined bees from a single-cohort colony, in which all individuals were at the same age; but some were nursing, while others were foraging. All the bees, independent of age or behavior, were able to activate the immune system after infection with S. marcescens. However, foragers, independent of age, were always more susceptible to infections than were nurse bees. This is probably due to physiological differences between bees, which confers to the nurses more competence to survivorship.
 
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Data de Publicação
2008-04-14
 
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