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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.17.2015.tde-01072015-092135
Documento
Autor
Nome completo
Maria Gabriela Fontanetti Rodrigues
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2015
Orientador
Banca examinadora
Giuliatti, Silvana (Presidente)
Correa, Luiz de Souza
Marin, Ana Lilia Alzate
Ramos, Ester Silveira
Zuben, Claudio Jose von
Título em português
Análise da Metilação do DNA de Seleções de Figueira (Ficus carica L.) por MSAP e Sequenciamento
Palavras-chave em português
Alterações epigenéticas
Bissulfito de sódio
ELISA
Figo
Radiação gama
Resumo em português
Os programas de melhoramento de figueira (Ficus carica L.) por métodos convencionais tais como cruzamentos dirigidos, para a obtenção de novos cultivares, são inviáveis em muitos países, como no Brasil, principalmente pela pequena variabilidade genética encontrada, e pela dificuldade de obtenção de plantas originadas pela fusão de gametas, uma vez que a vespa Blastophaga psenes, responsável pela polinização natural, não existe no país. Desse modo, o melhoramento genético, com o uso de mutagênicos, se torna uma linha de pesquisa importante para a melhoria da cultura, sendo necessário reunir informações sobre essa espécie, principalmente, em relação à sua variabilidade genética, para que projetos de propagação e manejo adequados sejam realizados. Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi verificar a existência de variabilidade epigenética devido à metilação do DNA em seleções irradiadas de figueiras, entre si e quando comparadas ao principal cultivar comercial, Roxo-de-Valinhos, utilizando as técnicas de MSAP e ELISA, e posterior sequenciamento do DNA, tratado com bissulfito de sódio, para detecção do posicionamento das regiões polimórficas, analisado por ferramentas de bioinformática. Amostras do DNA genômico foram duplamente digeridas com a enzima HpaII (sensível à metilação) ou com o seu isoesquizomero MspI (não sensível à metilação), juntamente com a enzima EcoRI. Foram testadas 14 combinações de primers e obteve-se 87.9%, 10.1% e 2.0%, respectivamente, de regiões não metiladas CCGG, regiões metiladas CmCGG e regiões hemimetiladas hmCCGG, de um total de 553 produtos de amplificação, demostrando que a técnica MSAP é eficiente para detecção de sítios diferencialmente metilados no material genômico estudado, evidenciando sua divergência epigenética. Com o sequenciamento do DNA isolado desses sítios diferencialmente metilados, foi possível verificar diferentes padrões de metilação nos mesmos pelo sequenciamento dos DNAs tratados com bissulfito de sódio, em regiões codificadoras de genes regulatórios do desenvolvimento e amadurecimento dos frutos, além de terem sido encontrados no DNA mitocondrial dos tratamentos, o qual regula o fornecimento de energia em forma de ATP para as plantas, estando intimamente relacionado com o desenvolvimento das mesmas, justificando os diferentes fenótipos encontrados, tanto nos frutos, quanto no crescimento das plantas que sofreram estresse devido à exposição à radiação gama. Pela técnica de imunoquímica (ELISA), utilizando anticorpos anti 5-mC, foram observadas diferenças significativas pelo teste de Tukey, a 95 % de confiabilidade, no conteúdo global de metilação dos DNAs dos tratamentos, indicando que este fator abiótico foi responsável pelas alterações no epigenoma das plantas. Como o material utilizado como controle se encontrou também metilado, uma possível desmetilação dos materiais genômicos pode ser a responsável pela variação fenotípica entre os tratamentos. Diante disso, o estudo futuro da expressão gênica entre os tratamentos torna-se uma estratégia de extrema importância para o entendimento dos complexos sistemas regulatórios, levando à identificação de genes de interesse agronômico para a cultura da figueira, possibilitando a sua manipulação subsequente e propagação de cultivares melhorados para fins comerciais.
Título em inglês
Analysis of Fig (Ficus carica L.) Selections DNA Methylation by MSAP and Sequencing
Palavras-chave em inglês
ELISA
Epigenetic alterations
Figs
Gamma radiation
Sodium bisulfite
Resumo em inglês
The fig tree (Ficus carica L.) breeding programs by conventional methods such as directed crosses, in order to obtain new cultivars, are unworkable in many countries, as in Brazil, mainly by small genetic variability found, and by the difficulty for obtaining plants originated from the fusion of gametes, since the wasp Blastophaga psenes, responsible for natural pollination, doesn`t exist in the country. In this way, the genetic breeding, with the use of mutagenic, becomes an important research line for the improvement of culture, being necessary to gather information about this species, mainly in relation to its genetic variability, for perform propagation projects and appropriate management. Given the above, The objective of this study was to verify the existence of epigenetic variability due to DNA methylation in irradiated fig selections, with each other and when compared to the main commercial cultivar, Roxo-de-Valinhos, using MSAP and ELISA techniques, and subsequent DNA sequencing, treated with sodium bisulfite, for detection of the position of the polymorphic regions, analyzed by bioinformatics tools. Samples of genomic DNA were double-digested with the HpaII enzyme (sensitive to methylation) with its isoschizomer MspI (insensitive to methylation), together with the EcoRI enzyme. Fourteen primer combinations were tested and it was obtained 87.9%, 10.1% e 2.0%, respectively, unmethylated CCGG, methylated CmCGG and hemimethylated regions hmCCGG, from a total of 553 amplification products, displaying, the MSAP technique, efficient for detection of differentially methylated sites in the genomic material studied, demonstrating their epigenetic divergence. With the sequencing of DNA isolated of these differentially methylated sites, it was possible to verify different patterns of methylation in them by sequencing the DNA treated with sodium bisulfite, in coding regions of regulatory genes of the development and fruits ripening, besides they have been found in the mitochondrial DNA of treatments, which regulates the supply of energy in ATP form for the plants, being closely related to their development, justifying the different phenotypes found in both fruits and plant growth that suffered stress due to exposure to gamma radiation. By the technique of immunochemistry (ELISA), using 5-mC antibodies, significant differences were observed by Tukey test, at 95% of trustworthiness, in the global content methylation of the treatments DNA, indicating that this abiotic factor was responsible for the changes in the epigenome of the plants. Since the material used as control was found also methylated, a supposed demethylation of the genomic material may be responsible for phenotypic variation among treatments. Considering this, future study of gene expression between treatments becomes an extreme important strategy for understanding the complex regulatory systems, leading to the identification of genes with agronomic interest for the fig culture, allowing its subsequent manipulation and propagation of improved cultivars for commercial purposes.
 
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Data de Publicação
2015-09-10
 
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  • RODRIGUES, M.G.F., et al. Search for methylation-sensitive amplification polymorphisms in mutant figs [doi:10.4238/2013.july.8.8]. Genetics and Molecular Research [online], 2013, vol. 12, p. 2267-2280.
  • RODRIGUES, M. G. F., et al. Different Patterns of DNA Methylation of Ficus carica Radiated Mutants. In 3ª RBC - Reunião Brasileira de Citogenética e IV SLACE - Simpósio Latino-Americano de Citogenética e Evolução, Guarujá, SP, 2013. Anais., 2013. Abstract. Available from: http://www.sigaeventos.com.br/3rbc/.
  • RODRIGUES, M. G. F., et al. Análise da Metilação do DNA de Seleções de Mutantes de Figueira por Marcadores Moleculares. In XXII Congresso Brasileiro de Fruticultura, Bento Gonçalves, RS, 2012. Anais.Vitória da Conquista, BA : Sociedade Brasileira de Fruticultura, 2012. Resumo. Dispon?vel em: http://www.congressofruticultura2012.com.br/.
  • RODRIGUES, M. G. F., et al. Search for Methylation-Sensitive Amplification Polymorphisms in Selections of Mutant Figs. In 58 Congresso Brasileiro de Genética, Foz do Iguaçu, PR, 2012. Anais., 2012. Abstract. Available from: http://sbg.org.br/2012/08/congresso-brasileiro/.
  • RODRIGUES, M. G. F., MARTINS, A. B. G., and GIULIATTI, S. Search for Methylation-Sensitive Amplification Polymorphisms in Selections of Mutants Figs (Ficus carica L.). In II Workshop e Reunião dos 40 Anos do Programa de Pós-Graduação em Genética, Ribeirão Preto, SP, 2011. Anais., 2011. Abstract.
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