O transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é um transtorno incapacitante que pode se desenvolver após exposição a eventos estressantes e traumáticos intensos. A neurobiologia da doença ainda é pouco compreendida, mas parece envolver diversos neurotransmissores, como glutamato, GABA, serotonina (5-HT), endocanabinoides e óxido nítrico. Uma alteração importante observada em pacientes com TEPT é o processamento anormal de memórias aversivas, levando à persistência exacerbada destas (prejuízo na extinção), bem como generalização do medo. Atualmente, os fármacos de escolha prescritos para o TEPT são os inibidores seletivos de recaptação de 5-HT, como a paroxetina, entretanto, muitos, se não a maioria, dos pacientes não apresentam melhora significativa. Evidências pré-clínicas e clínicas sugerem que o canabidiol (CBD), derivado não-psicotomimético da Cannabis sativa, é eficaz em atenuar comportamentos relacionados à exposição a estressores, principalmente via facilitação da ativação de receptores 5-HT1A e CB1, podendo ser potencialmente utilizado no tratamento do TEPT. Alguns efeitos do tipoansiolítico, mediados por drogas que atuam via receptores 5-HT1A, parecem depender da inibição da enzima óxido nítrico sintase neuronial (nNOS). Além disso, o aumento da sinalização nitrergica parece induzir várias alterações em componentes do sistema endocanabinoide. Portanto, o estresse pode induzir alterações importantes e promover modulações entre esses três sistemas: nitrérgico, serotoninérgico e canabinóide no SNC. Nosso objetivo foi avaliar se administrações agudas ou repetidas (7 dias) de CBD e 7- nitroindazole (7-NI - um inibidor preferencial da nNOS) poderiam prevenir a sensibilização das respostas de medo condicionado e os prejuízos nos processos de retenção da memória de extinção induzidas pela exposição a um estresse severo. Nós também investigamos se o efeito CBD envolveria os receptores 5-HT1A e / ou CB1. Além disso, testamos se o comprometimento induzido pelo estresse no processamento das respostas de medo condicionado (MC) estaria associado a modificações no sistema NO. Para isso Ratos Wistar (260g-280g) foram expostos ao estresse prolongado único (SPS - Single ProlongedStress), um modelo experimental de TEPT, que consiste em expor os animais a estressores sucessivos: estresse de restrição (2h); nado forçado (20 minutos) e perda de consciência pelo éter (avaliados pela perda do tônus postural). Uma semana depois foram avaliadas respostas de sensibilização ao MC e prejuízos nos processos de retenção da memória de extinção. Foram analisados, no hipocampo ventral (HV) e região pré-limbica do CPFvm (PL-CPFvm), níveis da isoforma fosforilada da enzima nNOS (pnNOS) em diferentes momentos após o estresse. Além disso, 2-3 horas após SPS os animais foram tratados com veículo, Paroxetina (5, 10 e 20 mg/kg), CBD (2,5, 5 e 10 mg/kg; 30mg/kg para tratamento agudo) ou 7-NI (15, 30 e 60 mg/Kg). As injeções foram administradas diariamente durante 7 dias. 7-NI (15, 30 e 60 mg/Kg) e CBD (30 mg/kg) foram administrados de forma aguda. Num grupo independente de animais, o antagonista do receptor 5-HT1A, WAY100635 (0,3 mg / kg) ou o antagonista do receptor CB1, AM281 (0,5 mg / kg) foram administrados 30 minutos antes do CBD (5 mg/kg). Vinte e quatro horas após a última injeção do fármaco (ou 7 dias depois para os tratamentos agudos) os ratos foram submetidos ao procedimento de medo condicionado contextual (MCC; três choques elétricos nas patas, 0,35 mA / 2s). A sensibilização das respostas de MC e déficits nos processos de consolidação da mémoria de extinção foram avaliadas em duas sessões distintas nas próximas 48 h. Verificou-se um aumento nos níveis de pnNOS no HV 1h após SPS, e no PL-CPFvm após a última avaliação comportamental (10°d - retenção da memória de extinção) (p <0,05). Sugere-se que essas duas estruturas modulam os efeitos do estresse em momentos diferentes. O SPS também foi capaz de induzir sensibilização das repostas de MC, aumentando o comportamento de congelamento na primeira re-exposição ao contexto aversivo (F (1,13) = 8,42, p <0,05) e prejudicou a retenção da memória de extinção (F (1,13) = 14,53, p <0,01). Esses efeitos foram atenuados pelo tratamento repetido (7 dias) com paroxetina (10 mg / kg) (p <0,05) e CBD (5 e 10 mg / kg) (p <0,05). Os efeitos do CBD (5mg / kg) foram abolidos pelo pré- tratamento com WAY100635 (0,03mg / kg) ou AM281 (0,05mg / kg). Curiosamente, uma dose única de 7-NI (30 e 60 mg / Kg) 2-3 horas após o SPS preveniu todas as consequências tardias do estresse avaliados 7 dias após o SPS. Além disso, decidimos analisar uma dose maior de CBD para investigar um possível efeito agudo. Descobrimos que uma única injeção de CBD (30 mg / kg) 2 a 3 horas após a SPS também evitou consequências tardias do estresse (p <0,05). Nossos resultados indicam que, em doses baixas, o CBD (5mg / kg) injetado sub-cronicamente (7 dias) é capaz de prevenir o aumento da sensibilização das respostas de medo condicionado, bem como atenuar os prejuízos nos processos de retenção da memória de extinção. Esses processos parecem acontecer via facilitação das neurotransmissões mediada por 5-HT1A e CB1. Além disso, uma única injeção de CBD, utilizando uma dose 6x maior do que a utilizada no tratamento repetido (30mg / kg), administradas após o SPS também foi capaz de evitar os efeitos tardios do estresse. Ainda, nossos dados sugerem que as mudanças comportamentais induzidas pelo estresse podem estar relacionadas a uma complexa modulação entre o HV e o PL-CPFvm, com modificações precoces e tardias, respectivamente, no sistema nitrérgico. Por fim, uma única administração de um inibidor preferencial da sintase neuronial do óxido nítrico (7- NI) injetada 2-3 horas após a SPS evitou todas as consequências comportamentais desencadeadas pelo estresse.

Stress exposure can induce maladaptive changes that might contribute to the development of a variety of neuropsychiatry disorders, such a Post-Traumatic Stress Disorder (PTSD), a chronic psychiatric condition usually associated with abnormalities in fear processing and changes in stress-coping behaviors. Psychological stressors can activate the nitric oxide (NO) system, an effect that has been related to PTSD. The first-choice pharmacological treatment for PTSD (selective serotonin reuptake inhibitor) presents a low clinical efficacy and high levels of side effects, therefore the pursuit of new therapeutic alternatives is relevant. Cannabidiol (CBD), the main non-psychotomimetic component of the plant Cannabis sativa, exerts therapeutically promising effects on human mental health such as inhibition of anxiety- and depression- related responses. Multiple mechanisms are involved in these therapeutic effects of CBD, including facilitation of endocannabinoid (ECB)- and 5-HT1A-mediated neurotransmission. Anxiolytic-like effects mediated by drugs acting via 5-HT1A receptors seems to depend on inhibition of neuronal NO synthase (nNOS) enzyme in the brain. Moreover, augmentation of NO signaling appears to induce several alterations in components of the ECB system. Therefore, it seems that stress can induce an important cross-talk between the nitrergic, serotonergic and endocannabinoid systems in the brain. We aimed at evaluating if, acute or repeated (7 days) injections of CBD and 7-nitroindazole (7-NI - a preferential inhibitor of neuronal nitric oxide synthase), could prevent the changes in fear processing induced by exposure to a severe stress. We also investigate if the CBD effect involves 5-HT1A and/or CB1 receptors. Furthermore, we tested if the stress-induced impairment of conditioned fear processing is associated with modifications in the NO system. Male Wistar rats (260g- 280g) were exposed to the single prolonged stress (SPS), a well-known model of PTSD, that consists of exposing animals to 3 stresses in sequence: restraint stress (2h); forced swim (20 minutes) and loos of consciousness by ether vapors (evaluated by loss of the postural tone). Fear sensitization and impaired extinction of conditioned fear were evaluated one week later. In the ventral hippocampus, the levels of phosphorylated neuronal NO synthase enzyme (pnNOS) were measured at different time points after stress. Moreover, 2-3 hours after SPS the animals were treated with vehicle, Paroxetine (5, 10 and 20mg/kg), CBD (2.5, 5 and 10 mg/kg; 30mg/kg for acute treatment) or 7-NI (15, 30 and 60mg/Kg). The injections were administered daily for 7 days. 7-NI (15, 30 and 60mg/Kg) and CBD (30mg/kg) were single injected. In an independent group of animals, the 5-HT1A-receptor antagonist WAY100635 (0.3 mg/kg) or the CB1-receptor antagonist AM281 (0.5 mg/kg) were administered 30 minutes before CBD (5 mg/kg). Twenty-four hours after the last drug injection (or 7 days later for acute treatments) the rats were submitted to a contextual conditioned fear procedure (three random electric footshocks, 0.35 mA/2s). Fear sensitization and extinction were assessed in two distinct sessions in the next 48 h. It was verified an increased pnNOS expression in the ventral hippocampus 1h after SPS, but not after the last behavioral evaluation (fear extinction consolidation) (p<0.05), suggesting that an initial activation of the nitrergic system seems to be involved in the later consequences of stress. We also found that SPS-induced fear sensitization increased freezing behavior in the first re-exposure to the aversive context (F(1,13) = 8.42, p<0.05) and impaired fear extinction (F(1,13) = 14.53, p<0.01). These effects were attenuated by repeated treatment (7days) with paroxetine (10 mg/kg) (p<0.05) and CBD (5 and 10 mg/kg) (p<0.05). CBD (5mg/kg) effects were abolished by pre-treatment with WAY100635 (0.03mg/kg) or AM281 (0.05mg/kg). Interestingly, a single dose of 7-NI (30 and 60 mg/Kg) 2-3 hours after the SPS prevented the fear sensitization and fear extinction impairment evaluated 7 days after stress. Furthermore, we decided to analyze a higher dose of CBD to investigate a possible acute effect. We found that a single injection of CBD (30 mg/kg) 2-3h after SPS also prevented delayed consequences of the stress (p<0.05). Our results indicate that, at low doses, CBD (5mg/kg) injected sub chronically (7 days) can attenuate stressinduced impairment in fear processing by facilitating 5-HT1A- and CB1-mediated neurotransmission. Furthermore, a single injection of CBD in a high dose (30mg/kg) after SPS also prevented stress effects. Moreover, the data suggest that stress-induced changes in behavioral responses could be partially related to early modifications in the nitrergic system, reflected by increase pnNOS expression in the ventral hippocampus found 1h after SPS. Also, a single dose of a nitric oxide synthase inhibitor (7-NI) injected 2-3 h after SPS prevented delayed consequences of stress.