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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.17.2018.tde-17042018-163626
Documento
Autor
Nome completo
José Vicente Gomes Filho
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2017
Orientador
Banca examinadora
Koide, Tie (Presidente)
Pereira, Tiago Campos
Cruz, Angela Kaysel
Silva Neto, José Freire da
Varani, Alessandro de Mello
Título em português
RNAs não-codificantes associados a IS200/605: identificação e caracterização funcional na archaea Halobacterium salinarum NRC-1
Palavras-chave em português
Archaea
Elementos móveis
RNA-seq
RNAs não-codificantes
Sequências de inserção
Resumo em português
Os elementos genéticos móveis (mobile genetic elements MGEs), são elementos extremamente importantes para plasticidade e evolução dos genomas. Uma das classes mais importantes de MGEs são as sequências de inserção (insertion sequences - IS). Estes elementos são encontrados em bactérias e archaea e apresentam grande diversidade de famílias e mecanismos de movimentação. Uma família interessante de IS é IS200/605, esta família encontra-se distribuída em bactérias, archaea e vírus e utiliza substratos de DNA de fita simples para seu processo de transposição. Neste trabalho, através da análise de dados públicos de transcritoma identificamos RNAs sobrepostos ao 3' de genes tnpB de IS200/605 em archaea e bactérias, estes transcritos foram chamados de sense overlapping transcripts (sotRNAs). As extremidades 5' e 3' dos sotRNAs foram mapeadas através de dados de RNA-seq de pequenos RNAs (sRNA-seq) e validadas através da técnica de C-RACE. Análises de sequência e estrutura secundária demonstraram que estes RNAs apresentam um motivo conservado chamado de RE-like. Utilizando a sequência consenso deste motivo pudemos identificar RNAs intergênicos derivados de IS200/605 em H. salinarum NRC-1. Para caracterização funcional, construímos linhagens superexpressando os RNAs VNG_sot0042 e VNG_R0052, ambos contendo o motivo RE-like. Curvas de crescimento, utilizando as linhagens construídas demonstraram que a superexpressão destes RNAs aumenta o crescimento de H. salinarum demonstrando sua funcionalidade. Devido a presença do motivo RE-like, extremidades 5' e 3' determinadas e fenótipo visualizado em curva de crescimento padrão, o sotRNA VNG_sot0042 foi estudado mais a fundo. Realizamos experimentos de RNA-seq para avaliar o impacto desta superexpressão no transcritoma de H. salinarum NRC-1, assim como experimentos de SILAC para identificação de proteínas parceiras em larga escala. Nestes ensaios identificamos proteínas e genes associados ao processo de adesão, geração de células persistentes e resistência a metais pesados. Ensaios de adesão e sobrevivência a metais pesados demonstraram que a linhagem de superexpressão apresenta maior capacidade de aderir a vidro e maior sobrevivência em diversas condições de estresse. Deste modo, podemos sugerir que ncRNAs derivados de IS200/605 são importantes moléculas regulatórias em H. salinarum NRC-1 e nos ajudam a compreender a manutenção de IS200/605 e seus derivados nos genomas de procariotos.
Título em inglês
Non-coding RNAs associated with IS200/605: Identification and functional characterizal in the archaea Halobacterium salinarum NRC-1
Palavras-chave em inglês
Archaea
Insertion sequences
Mobile elements
Non-coding RNAs
RNA-seq
Resumo em inglês
Mobile genetic elements (MGEs) are extremely important for plasticity and evolution of genomes. Their impacts are diverse and could be related to antibiotic resistence or symbiosis. One of the most important class of MGEs are insertion sequences (ISs). These elements are found widespread throughout bacteria and archaea, presenting a great diversity of families. An interesting family is the IS200/605, this family is found widespread in bacteria, archaea and viruses and is divided in three subgroups according to it's genetic composition: IS200 with tnpA gene alone, IS605 with tnpA and tnpB and IS1341 with tnpB only. Another interesting aspect is the utilization of single-stranded DNA as a substrate during the transposition process. In this work, through the analysis of public available transcriptomic data we identified transcripts that overlaps the 3' end of tnpB in IS200/605 in both bacteria and archaea. These transcripts were named sense overlapping transcripts (sotRNAs). Sequence and secondary structure analysis showed a conserved motif present in sotRNAs, the RE-like motif. Using the consensus sequence of this motif we identified novel intergenic ncRNAs containing this motif that are derived from IS200/605. For functional characterization we overexpressed a sotRNA (VNG_sot0042) and a intergenic (VNG_R0052), both containing the RE-like motif. Standard growth curves demonstrated that the overexpression of these ncRNAs improve H. salinarum growth showing that this RNA is functional. To further evaluate the impact of the overexpressions we prepared RNA-seq libraries of the strain overexpressing VNG_sot0042 and in parallel performed SILAC experiments to identify potential protein-RNA interaction partners. Differentially regulated genes and interacting proteins associated with adhesion and persistent cells generation were found. Adhesion and survival assays showed that the lineage overexpressing VNG_sot0042 has a better capability to adhere in glass surfaces and survive more in diverse stressful conditions.
 
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Data de Publicação
2018-07-17
 
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