Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2003.tde-27112003-081745
Document
Author
Full name
Joanne Neves Moraes
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2003
Supervisor
Committee
Rodriguez, Adriana Pinheiro Martinelli (President)
Cristofani, Mariangela
Melo, Murilo de
Title in Portuguese
Análise comparativa da embriogênese somática em Citrus sinensis, var. valência, e Citrus limonia, var. limão cravo.
Keywords in Portuguese
embriogênese somática
expressão gênica
laranja
limão
marcador molecular.
Abstract in Portuguese
A embriogênese somática é uma técnica alternativa com potencial
aplicação na propagação clonal de plantas, além de ser uma excelente
ferramenta para estudos básicos e análise dos eventos moleculares e
bioquímicos que ocorrem durante a embriogênese vegetal. Contudo, apesar de
várias pesquisas relativas a embriogênese somática, a falta de conhecimento
sobre os fatores que controlam o fenômeno, comprova que existem ainda
muitos pontos a serem entendidos sobre o processo. Deste modo, o presente
estudo foi concebido com o intuito de estudar a embriogênese somática de
duas espécies de citros, as quais apresentam diferentes graus de eficiência na
produção de embriões somáticos. Inicialmente, buscou-se avaliar
comparativamente o processo de embriogênese somática de duas espécies de
citros, observando-se as diferenças estruturais através de análises histológicas
e histoquímicas, e as diferenças na expressão do gene AtSERK1 nos calos,
através de hibridização in situ. Para instalação dos experimentos, foram
utilizados calos provenientes de nucelos de duas espécies, Citrus sinensis L.
Osbeck, variedade Valência, e Citrus limonia Osbeck, variedade limão Cravo.
Amostras de calos em meio de multiplicação, em meio de obtenção de embriões, e embriões somáticos nas diferentes fases de desenvolvimento foram
coletados para observações anatômicas e histoquímicas através de
microscopia óptica e realização de estudo da expressão gênica através de
hibridização in situ. Com relação à morfologia, os principais resultados obtidos
demonstraram que existem diferenças anatômicas e histoquímicas entre calos
de limão Cravo e Valência. Em relação à expressão gênica, os resultados
evidenciaram a expressão do gene AtSERK1 em calos das duas espécies de
citros, tanto em meio de multiplicação, com sacarose, como em meio de
indução, com maltose, indicando que o potencial embriogênico já está instalado
no calo em meio de multiplicação. Pode-se concluir também que este gene é
conservado entre Arabidopsis e Citrus. Desenvolveram-se, também,
experimentos para estudar os efeitos de alguns tratamentos (frio, dessecação,
agrupamentos celulares) na otimização da indução e sincronização da
embriogênese somática de C. sinensis, var. Valência. Neste sentido, calos
nucelares de laranja Valência, procedentes do meio de multiplicação foram
mantidos no mesmo meio líquido em agitador orbital a 200 rpm durante 24h e
posteriormente peneirados de acordo com os tratamentos. As peneiras
utilizadas apresentaram malhas de 150 µm (P1), 300 µm (P2) e 600 µm (P3).
Além do efeito das peneiras também foram observados os efeitos de exposição
ao frio (4 o C por quatro semanas, ausência de luz) e dessecação (27 o C, em
placas de Petri na ausência de meio de cultura, seis dias, ausência de luz),
sendo posteriormente mantidos em B.O.D., a 26 ± 1 o C e intensidade luminosa
de 300 lux. Os resultados obtidos permitiram concluir que em relação ao
desenvolvimento e produção de embriões somáticos o fator peneira foi superior
ao fator estresse na freqüência embriogênica. O desenvolvimento de embriões
somáticos em Citrus sinensis ocorre mais eficientemente a partir de
agrupamentos celulares de tamanhos específicos.
Title in English
Comparative analysis of somatic embryogenesis in citrus sinensis, var. valencia, and citrus limonia, var. rangpur lime.
Keywords in English
gene expression
lemon
molecular marker.
orange
somatic embryogenesis
Abstract in English
Somatic embryogenesis is an alternative technique with potential
application for clonal propagation of plants, and an excellent tool for basic
studies and analysis of the molecular and biochemical events that occur during
embryogenesis. However, although many studies have been done, the factors
that control somatic embryogenesis are not completely understood. Thus, the
present study proposes to evaluate aspects of somatic embryogenesis of two
citrus species, which differ in efficiency for the production of somatic embryos.
Initially, a comparison of the embryogenic process was done in terms of
structural and histochemical analysis and evaluation of the expression of the
gene AtSERK1 in callus cultures through in situ hybridization. For the
experiments, callus cultures obtained from nucelli of two species, Citrus sinensis
L. Osbeck, cv. Valencia, and Citrus limonia Osbeck, cv. Rangpur lime were used
for anatomical and histochemical observations, callus samples from cultures in
multiplication medium, in embryo induction medium, and somatic embryos in
different stages of development were collected. Callus and embryo samples
were also collected for analysis of gene expression through in situ hybridization.
The anatomical and histochemical analysis showed differences between Rangpur lime and Valencia callus cultures. The in situ hybridization results
evidenced the expression of the gene AtSERK1 in cultures of both citrus
species, and also in both culture conditions: multiplication medium, with sucrose,
and embryo induction medium, with maltose, indicating that the embriogenic
potential is already installed in the callus cultures in multiplication medium. The
results also lead to the conclusion that the gene is conserved between
Arabidopsis thaliana and Citrus. Experiments aiming to synchronize the somatic
embryogenesis formation in C. sinensis, cv. Valencia, were installed testing the
effect of cold, desiccation and cell cluster size on somatic embryo formation. For
that, callus cultures of Valência sweet orange were cultivated in liquid medium
in an orbital shaker, at 200 rpm, for 24h, and sieved through the following
screens: 150 µm (P1), 300 µm (P2) and 600 µm (P3). The cell aggregates were
then exposed to cold (4 o C, for four weeks, in the dark) and desiccation (27 o C, in
Petri plates without culture medium, six days, in the dark) treatments, and
cultured in incubators at 26 ± 1 o C and 300 lux of light intensity. The results lead
to the conclusion that the separation of cultures in clusters of different sizes and
the stress treatments were effective for synchronization and embryogenesis
frequency. The size of cell clusters was the most important factor.
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Publishing Date
2003-11-28
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- SOUZA, J. M. M., et al. Callus sieving is effective in improving synchronization and frequency of somatic embryogenesis in Citrus sinensis [doi:10.1007/s10535-011-0072-0]. Biologia Plantarum [online], 2011, vol. 55, p. 703-707.
- Moraes, J. N., Arruda, S. C. C., e RODRIGUEZ, A. P. M. Influência do estresse e tamanho de agrupamentos celulares na obtenção de embriões somáticos a partir de cultura de calos em Citrus sinensis L. Osbeck. Brazilian Journal Of Plant Physiology, 2003, vol. 15, nº Suplemento, p. 180. Resumo.
- Souza, J. M. M., et al. Callus sieving is effective in improving synchronization and frequency of somatic embryogenesis in Citrus sinensis [doi:10.1007/s10535-011-0072-0]. Biologia Plantarum (Praha) [online], 2011, vol. 55, p. 703-707.
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- Moraes, J. N., et al. Expressão diferencial de genes em calos embriogênicos e não embriogênicos de citros (Citrus spp). In 48 Congresso Nacional de Genética, Águas de Lindóia, SP, 2002. Resumos do 48 Congresso Nacional de Genética.Ribeirão Preto, SP : Sociedade Brasileira de Genética, 2002. Resumo. Dispon?vel em: www.sbg.org.br.