A busca por soluções sustentáveis, levando a um processo energético mais eficiente induziu a novas tecnologias e esforços estão sendo realizados para viabilizar o etanol de segunda geração, com o aproveitamento da biomassa celulolítica como substrato para a fermentação alcoólica. Contudo, durante a hidrólise do bagaço, muitos compostos tóxicos à levedura são formados como o furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético, e compostos fenólicos com efeitos depressivos sobre a fermentação. A adição de melaço no hidrolisado de bagaço poderia permitir uma fermentação com maior teor alcoólico, contribuindo para um balanço energético favorável da destilação, além de propiciar nutrientes minerais e orgânicos para a levedura. Tais nutrientes poderiam permitir um processo fermentativo com reciclo de células de leveduras aproveitando assim uma estrutura e conhecimentos já existentes na destilaria de etanol de primeira geração. O reciclo de células permitiria fermentações rápidas, porém impõe repetidas condições estressantes, o que torna um grande desafio a obtenção de linhagens com o perfil de tolerância desejado. Assim este trabalho se propôs a selecionar linhagens de Saccharomyces cerevisiae com múltiplas tolerâncias em relação aos inibidores tanto presentes no hidrolisado como no melaço. Para tal, foram impostas condições estressantes sobre culturas da linhagem SA-1 e de leveduras isoladas de destilarias brasileiras durante cerca de 62 gerações, forçando uma evolução adaptativa ou mesmo um enriquecimento/seleção de indivíduos mais tolerantes. Paralelamente a biodiversidade de linhagens isoladas de destilarias foi avaliada quanto aos atributos de tolerância aos compostos tóxicos presentes no hidrolisado do bagaço. As linhagens com maiores desempenhos foram avaliadas em fermentações com reuso de células empregando-se substrato constituído de hidrolisado e melaço, sendo que 4 linhagens se mostraram superiores às linhagens referenciais. Destas, dois isolados (242 e 408) foram esporulados e os conjuntos dos haploides foram empregados em cruzamentos massais. Simultaneamente, 273 haploides isolados das linhagens 242 e 408 foram avaliados quanto ao crescimento (DO_600nm) em substrato constituído por hidrolisado e melaço, sendo que 32 foram selecionados. Após a tipificação segundo o "mating type" os mesmos foram utilizados em cruzamentos direcionados mediante micromanipulação, resultando em 35 cruzamentos. Cinco híbridos de cada cruzamento direcionado foram resgatados (155 isolados), que juntamente com 80 isolados oriundos do cruzamento massal, foram novamente avaliados quanto ao crescimento (DO_600nm) e a seguir em fermentações com reciclo de células. Cinco linhagens se destacaram como superiores aos parentais, demonstrando que mediante o protocolo empregado foi possível incrementar o perfil de tolerância de Saccharomyces cerevisiae para suportar os estresses impostos por um substrato para produção do etanol de segunda geração.

The search for sustainable solutions to improve process efficiency has promoted the development of new technologies, and the use of cellulolytic biomass as the substrate for fermentation has emerged as a promising second-generation ethanol production strategy. However, the hydrolysis of this material results in the formation of toxic compounds to yeast such as furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid and phenolic compounds, with deleterious effects on fermentation. Addition of molasses in the bagasse hydrolysate could allow fermentation with higher alcohol content contributing to a favorable energy balance in the distillation, as well as providing minerals and organic nutrients for the yeast. These nutrients could allow a fermentative process with yeast cell recycle, utilizing the structure and knowledge already existing in first generation process. The cell recycle enables a rapid fermentation, but imposes repeated stress conditions, making it challenging to obtain strains with the desired tolerance profile. The purpose of this study was to select Saccharomyces cerevisiae strains with multiple tolerances to inhibitors present in the hydrolysate and molasses. Stressful conditions were imposed on cultures of SA-1 strain and indigenous strains from Brazilian distilleries for around 62 generations, forcing an adaptive evolution or even an enrichment / selection of more tolerant individuals. In parallel, the biodiversity of the strains from Brazilian distilleries were evaluated with respect to their tolerance to the toxic compounds present in bagasse hydrolysate. The strains that showed higher performance were assessed in fermentations with cell reuse employing substrate composed by hydrolyzate and molasses. Four of the analyzed strains exhibited better performance than the reference strain. Of these, two isolates (242 and 408) were sporulated and the haploids were subjected to mass mating. Simultaneously, 273 haploids rescued from the strains 242 and 408 were evaluated for growth (OD 600 nm) in the substrate consisting of hydrolysate and molasses, and among them 32 were selected. After the characterization according to the "mating type", the haploids were utilized in direct mating induced by micromanipulation, totaling 35 crossings. Five hybrids from each direct mating were rescued (totaling 155 isolates), which together with 80 isolated from the mass mating, were evaluated for growth (OD 600 nm) and then in fermentation with cell recycle. 5 strains have excelled as superiors to the reference strain showing that by the protocol employed was possible to increase profile of tolerance of Saccharomyces cerevisiae to resist pressures imposed by a substrate for second-generation ethanol production.