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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.11.2016.tde-28112016-153832
Document
Auteur
Nom complet
Isabela Moraes Ascencio
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 2016
Directeur
Jury
Basso, Luiz Carlos (Président)
Silveira, Marcos Henrique Luciano da
Verdi, Maria Carolina Quecine
Titre en portugais
Seleção de fungos filamentosos produtores de hidrolases e pré-otimização das condições de cultivo
Mots-clés en portugais
Aspergillus brasiliensis
Trichoderma reesei
Agentes tamponantes
Biomassa
Celulases
Fontes de carbono
Fontes de nitrogênio
Hidrólise
Xilanases
Resumé en portugais
A crescente demanda por energia e a necessidade de promover o desenvolvimento sustentável colocam em foco os combustíveis renováveis. Dentro de biocombustíveis, os 2G ou segunda geração, têm como objetivo a utilização da energia contida na biomassa vegetal. Muitos microorganismos são capazes de excretar enzimas que quebram a lignocelulose, o principal componente das paredes celulares da planta, em açúcares fermentáveis. Os objetivos deste trabalho foram selecionar fungos filamentosos que produzem enzimas que degradam a biomassa e otimizar suas condições de cultivo. Quatro isolados e duas linhagems padrão foram testadas para a produção de celulases e identificadas pelo sequencimaneto da região ITS (Internal Transcribed Spacer). Após a caracterização inicial, três linhagens foram selecionadas e testadas em diferentes fontes de nitrogênio e carbono, e agentes tamponantes, visando o cultivo ótimo para cada delas. As condições ideais foram escolhidas com base em critérios de atividade enzimática, proteínas totais liberadas e pH. Após o estabelecimento das condições ótimas, os sobrenadantes das culturas foram liofilizados e o teor de proteínas determinado. O mesmo extrato foi testado quanto à FPA (Filter Paper Activity), atividades de β-glicosidase e xilanases, e quanto sua capacidade hidrolitica na biomassa pré-tratada. As linhagens selecionadas foram identificadas como Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) e a linhagem padrão Trichoderma reesei QM9414. A melhor combinação de fontes de nitrogênio foi a razão 4:3:3; 5:3:2 e 6:3:1 (sulfato de amónio, ureia e extrato de levedura) para F88, F811 e T. reesei, respectivamente. O ácido cítrico foi selecionado como agente tamponante para F88 e T. reesei, e PIPES para F811. Bagaço pré-tratado por explosão a vapor (BPT), como fonte de carbono, foi o melhor para induzir a produção de celulases e xilanases por F88 e F811, enquanto, Solka-Floc® foi a melhor para T. reesei. As atividades de β-glicosidase e xilanase foram maiores em F811 do que para T. reesei. No entanto, para FPA, T. reesei apresentou o melhor rendimento. Nos ensaios de hidrólise, as conversões de glicana e xilana foram semelhantes para ambas as linhagens, mesmo havendo acúmulo de celobiose no ensaio de T. reesei. Comparando os dados obtidos para ambas linhagens, uma selvagem e outra que é considerada referência industrial, F811 se mostrou promissor para a produção de enzimas hidrolíticas e como consequência, a habilidade em transformar a biomassa em açúcares fermentáveis.
Titre en anglais
The selection of filamentous fungi that produce hydrolases and the preoptimization of their growth conditions
Mots-clés en anglais
Aspergillus brasiliensis
Trichoderma reesei
Biomass
Buffers
Carbon source
Cellulases
Hydrolysis
Nitrogen source
Xylanases
Resumé en anglais
The increasing demand for energy and the necessity to promote sustainable development has focused on renewable fuels. Within the available biofuels, 2G or second generation, has the aim of releasing the energy contained in plant biomass. Many microorganisms are able to secret enzymes capable of breaking down lignocellulose, the main component of plant cell walls, into fermentable sugars. The objectives of this project was to select filamentous fungi that produce enzymes that degrade biomass and optimize the growth conditions for them. Four isolates and two standards strains were tested for the production of cellulases and identified by ITS (Internal Transcribed Spacer) sequencing. After initial characterization, three strains were selected and tested in different sources of nitrogen and carbon, and buffering agents for optimal growth. The ideal conditions were chosen based on the criteria of enzymatic activity, total proteins released and pH. After the ideal condition for each strain were established, cell free extracts from each culture were lyophilized and the total protein content determined. This extract was tested for FPA (Filter Paper Activity), β- glucosidase and xylanase activity and the hydrolysis assays were carried out using pretreated biomass. The selected strains were identified as Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) and the standard strain Trichoderma reesei QM9414. The best combination of nitrogen sources was the ratio 4:3:3; 5:3:2 and 6:3:1 (ammonium sulfate, urea and yeast extract) for F88, F811 and T. reesei, respectively. Citric acid was selected as buffering agent for F88 and T. reesei, and PIPES for F811. Steam exploded bagasse, as a carbon source, was the best to induce the cellulase and xylanase production for F88 e F811, while, Solka-floc® was better for T. reesei. The activities of β-glucosidase and xylanase were higher for F811 than for T. reesei. However, for FPA, T. reesei showed the best yield. In the hydrolysis assays, conversions of glucan and xylan were similar for both strains, even though there was an accumulation of celobiose in the T. reesei's assay. Comparing the data obteined for both strains, a wild type and an industrial reference, F811 showed as a promising strain to produce hydrolytic enzymes and as consequence, break down biomass into fermentable sugars.
 
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Date de Publication
2016-12-13
 
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