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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.11.2007.tde-14032007-150445
Documento
Autor
Nome completo
Simone Cristina Braga Bertini
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2006
Orientador
Banca examinadora
Tavares, Flavio Cesar Almeida (Presidente)
Almeida, Juan Lucas Argueso Gomes de
Pizzirani-kleiner, Aline Aparecida
Título em português
Obtenção de levedura híbrida fluorescente e resistente a nistatina
Palavras-chave em português
Antifúngicos
Cana-de-açúcar
Fermentação alcoólica
Leveduras
Melhoramento genético
Resumo em português
A contaminação de dornas por leveduras selvagens pode prejudicar o rendimento e a produtividade da produção industrial de etanol, inexistindo métodos eficientes para o controle deste tipo de contaminação. Facilidade, rapidez e o baixo custo seriam características desejáveis para o controle de leveduras que eventualmente contaminam o processo de fermentação. Com este objetivo, TAVARES (1989) desenvolveu um processo de produção de etanol com o controle de leveduras contaminantes, que utiliza um híbrido M606 de Saccharomyces cerevisiae de alta produtividade e resistente a nistatina, um antifúngico de amplo espectro que pode ser usado para garantir a pureza genética do inóculo industrial. Para facilitar a identificação de leveduras GOMES et al. (2000), utilizaram a propriedade de fluorescência expressada pelo gene GFP "Green Fluorescent Protein" sob o controle do promotor da da ADH2 em baixas concentrações de glicose. Associar estas duas propriedades em uma levedura industrial permitiria manter a pureza do inóculo e facilitaria a sua identificação. Com este objetivo, foram efetuados experimentos de transformação genética do híbrido M606 com o plasmídio pYGFP3 construído por Gomes et al (2000), sem obter o sucesso desejado. Por isto, como passo inicial para obtenção de ambas propriedades em híbrido altamente produtivo, optou-se pela metodologia de cruzamentos entre uma linhagem segregante haplóide resistente a nistatina M606-2c(n) e a linhagem X2904- GFP3 portadora do plasmídio pYGFP3. Alguns híbridos deste cruzamento natural foram selecionados, para posterior avaliação do nível de resistência à nistatina, da estabilidade do plasmídio pYGFP3 e da capacidade fermentativa. Verificou-se que os híbridos selecionados (P16, P34 e P42) foram capazes de crescer numa concentração de 10mg.L-1 de nistatina. Contudo, detectou-se instabilidade do plasmídio pYGFP3 em todos os híbridos selecionados. Os híbridos P34 e P42 demonstraram uma capacidade fermentativa inferior às linhagens controle, o que pode ser explicado pela fragilidade do sistema de membranas decorrente da natureza da resistência à nistatina. O híbrido P16 não apresentou diferenças na capacidade de fermentação em relação as linhagens controle. Apesar de obter híbridos resistentes a nistatina expressando o gene GFP3, verifica-se que há necessidade de modificar o plasmídio pYGFP3 tornando-o integrativo no genoma da levedura, para permitir a estabilidade do gene GFP3.
Título em inglês
Obtaining a fluorescent and resistant hybrid yeast to the nystatin
Palavras-chave em inglês
Fermentation
Genetic transformation
Saccharomyces
Resumo em inglês
Vats contamination by wild yeasts can harm the efficiency and the productivity of ethanol industrial production and there are not efficient methods to control this type of contamination. Easiness, speed and the low cost would be desirable characteristics for the control of yeasts that eventually contaminate the fermentation process. With this aim, TAVARES (1989) developed an ethanol production process with the control of spoilage yeasts contaminants, that uses a Saccharomyces cerevisiae hybrid M606, of high productivity and resistant to the nystatin. It´s a wide spectrum antifungal that can be used to guarantee the genetic purity of the industrial inoculum. To facilitate the yeasts identification, GOMES et al. (2000) used the fluorescence property expressed by the GFP gene "Green Fluorescent Protein", that is controlled by the promoter of ADH2 in a low glucose concentrations. The association of these two properties in an industrial yeast strain would allow to maintain the purity of the inoculum and it would facilitate its identification. With this aim, an assay of genetic transformation of hybrid M606 with pYGFP3 plasmid built by Gomes et al (2000) was made, but it had not success. Therefore, as initial step for obtaining of both properties in hybrid highly productive, It was opted for the methodology of crossings between a nystatin resistant haploid segregant strain M606-2c(n) and the strain X2904-GFP3(n) harboring of the plasmid pYGFP3. Some hybrids were selected of this natural crossing, with subsequent evaluation of nystatin resistance level, stability of the pYGFP3 plasmid and fermentative capacity. The selected hybrids (P16, P34 and P42) were capable to grow in a concentration of 10mg.nystatin L-1. However, plasmidial instability of the pYGFP3 was detected in all the selected hybrids. The hybrids P34 and P42 showed a smaller fermentative capacity than control strain, which can be explained by the fragility of the membranes system due to the nature of the resistance to the nystatin. The hybrid P16 did not showed difference in the fermentative capacity to the strain control. In spite of obtaining resistant hybrid to the nystatin expressing the GFP3 gene, there is a need to modify the pYGFP3 plasmid, turning it integrative in the yeast genome to allow the gene stability GFP3.
 
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SimoneBertini.pdf (323.88 Kbytes)
Data de Publicação
2007-03-24
 
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