Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2004.tde-25032004-144344
Document
Author
Full name
Gunta Gutmanis
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2003
Supervisor
Committee
Labate, Carlos Alberto (President)
Mourao Filho, Francisco de Assis Alves
Nascimento, João Roberto Oliveira do
Title in Portuguese
Clonagem do cDNA que codifica a enzima UDP-glicose pirofosforilase de batata (Solanum tuberosum L.).
Keywords in Portuguese
batata
bioquímica
biotecnologia de plantas
celulose
clonagem
dna complementar
enzimas
polissacarídeos
Abstract in Portuguese
A biotecnologia está revolucionando a atividade humana nas mais diversas áreas.
No setor florestal, as novas tecnologias como transgenia, genômica, proteômica e
bioinformática, estão sendo rapidamente incorporadas. A associação dessas tecnologias
aos programas de melhoramento convencional de árvores pode acelerar o processo de
obtenção de árvores com características específicas da madeira para a indústria de papel e
celulose. UDP-glicose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na
produção de UDP-glicose, intermediário na interconversão de carboidratos envolvidos
em várias funções metabólicas, como síntese de sacarose e de celulose. No presente
trabalho, foi clonado o cDNA que codifica a UGPase. Este cDNA foi sintetizado por
meio de RT-PCR utilizando-se mRNA extraído de tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.). Os primers específicos para a ORF do gene da UGPase foram definidos
com base em seqüências conservadas entre genes ortólogos, já disponíveis em bancos de
dados. O cDNA foi clonado no vetor pENTR-D TOPO e inserido, por meio de
transformação química, em células competentes de Escherichia coli. O DNA plasmidial
foi purificado e após seu sequenciamento, a presença de um inserto de 1402 pb foi
confirmada. O alinhamento da seqüência deduzida de aminoácidos com outras UGPases
revelou alta homologia a UGPases de batata e de outras espécies vegetais. Na seqüência
do cDNA clonado foram identificados sítios de N-glicosilação, resíduos lisina e motivos
conservados que possivelmente estão relacionados tanto com a capacidade de ligação ao
substrato, como com a atividade catalítica da enzima. Também foi realizada uma análise
de Southern blot para confirmar a presença deste gene no DNA genômico de batata e de
eucalipto (Eucalyptus grandis). Posteriormente, o cDNA clonado será utilizado na
avaliação do impacto de sua superexpressão na biossíntese de celulose e hemiceluloses e
no desenvolvimento de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto.
Title in English
Cloning of cdna encoding potato (Solanum tuberosum L.) udp-glucose pyrophosphorylase.
Keywords in English
biochemistry
cellulose
cloning
complementar DNA
enzyme
plant biotechnology
polissacarides
potato
Abstract in English
Biotechnology is revolutionazing human activity in several fields. In forestry,
new technologies like transgenies, genomics, proteomics and bioinformatics have been
quickly consolidated. Assossiating these technologies with conventional forestry
breeding will accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties
for the paper and pulp industry. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9)
is a key enzyme producing UDP-glucose, an important intermediate in carbohydrate
interconversion involved in various metabolic processes like sucrose and cellulose
synthesis. In this work, it was cloned the cDNA that encodes UGPase. This cDNA was
synthetized through RT-PCR using RNA extracted from potato (Solanum tuberosum L.)
tuber. The UGPase primers were designed based on the conserved sequences of
hortologous genes, already available in public data banks. The cDNA was cloned into
pENTR-D TOPO vector and introduced into Escherichia coli competent cells, by
chemically transforming. The plasmid DNA was purified and the insert PCR amplified. The presence of 1402 bp insert was confirmed after sequencing. The alignment of the
derived amino acids sequence with other UGPases revealed high homology to UGPases
from potato and other plant species. Along the cDNA sequence N-glicolisation sites,
Lysyl residues and conserved domain were identified, which probably are involved in
substrate binding capacity, as well as catalytic ativity of the enzyme. Southern blot
analysis was carried to confirm the presence of this gene in potato and eucalypt
(Eucalyptus grandis) genomic DNA. The cloned cDNA will be used to evaluate the
impact of overexpression on celullose and hemicelluloses biosynthesis and in the tobacco
(Nicotiana tabacum) and eucalypt plant development.
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Publishing Date
2004-03-29