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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.11.2006.tde-22112006-143915
Documento
Autor
Nome completo
Evandro Henrique Schinor
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2006
Orientador
Banca examinadora
Mendes, Beatriz Madalena Januzzi (Presidente)
Carrer, Helaine
Harakava, Ricardo
Mourão Filho, Francisco de Assis Alves
Stuchi, Eduardo Sanches
Título em português
Organogênese in vitro e transformação genética em Citrus sp. com o gene da capa protéica e uma seqüência conservada antisense do vírus da tristeza dos citros
Palavras-chave em português
Agrobacterium
Cultura de tecidos vegetais
Frutas cítricas
Organogênese
Resistência genética vegetal
Seqüenciamento genético
Transformação genética
Tristeza cítrica
Resumo em português
O presente trabalho teve como principal objetivo obter plantas transgênicas, dos cultivares porta-enxerto limão 'Cravo' e laranja azeda e de cultivares copa de laranja doce, expressando genes que possam influenciar no nível de resistência ao vírus da tristeza dos citros (CTV) e, possivelmente à morte súbita dos citros. Buscou-se ainda estudar a organogênese in vitro de espécies cítricas. Experimentos para a indução da organogênese in vitro foram realizados a partir de segmentos de epicótilos de plântulas germinadas in vitro de espécies cítricas avaliando-se: a resposta organogênica de três diferentes regiões do epicótilo, na presença (1,0 mg.L-1) ou ausência de BAP, em meio MT, e a regeneração em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) adicionadas ao meio MT. Também avaliou-se a regeneração de segmentos internodais de limão ?Cravo? e laranja azeda em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) em meio MT; e de laranja azeda em meio de cultura MT e DBA3, suplementados com diferentes concentrações de BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) e ANA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). Foi utilizado o método de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens utilizando-se tecido juvenil coletado de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais) como explantes. Utilizou-se a estirpe EHA105 de A. tumefaciens, contendo os plasmídeos: a) pCTV-CP: contendo o gene da capa protéica do CTV; b) pCTV-dsCP: contendo repetições invertidas do gene da capa protéica do CTV, interligadas pelo intron do gene da quitinase de citros; c) pCTVcons: contendo uma seqüência conservada antisense do CTV. As construções gênicas foram elaboradas a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e o terminador NOS. Foram utilizados também os genes de seleção nptII e o repórter GUS. As gemas adventícias desenvolvidas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e por PCR e a confirmação da transformação genética foi feita por Southern Blot. A expressão da proteína do CTV foi verificada pelo teste serológico de PTA-ELISA. A resposta morfogênica em função da região do epicótilo e das concentrações da citocinina BAP é dependente do cultivar de citros. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP proporcionou um maior número de gemas adventícias regeneradas por explante, tanto em segmentos de epicótilo como em segmentos internodais dos cultivares de citros estudados. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP é essencial na regeneração de gemas adventícias em segmentos internodais de laranja azeda. Foi possível regenerar plantas transgênicas, pelo protocolo de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens de limão 'Cravo' contendo o gene da capa protéica do vírus da tristeza dos citros (pCTV-CP) utilizando-se segmentos de epicótilo e segmentos internodais como fonte de explante, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos internodias; e de laranja 'Hamlin' contendo o gene da capa protéica do CTV, com as construções gênicas pCTV-dsCP e pCTV-CP, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos de epicótilo como fonte de explante.
Título em inglês
In vitro organogenesis and genetic transformation of Citrus sp. with the coat protein gene and an antisense untranslated region of the Citrus tristeza virus
Palavras-chave em inglês
Agrobacterium
Citric fruits
Citrus tristeza
Genetic sequencing
Genetic transformation
Organogenesis
Plant genetic resistance
Plant tissue culture
Resumo em inglês
The objective of the present work was to obtain transgenic plants of rootstocks Rangpur lime and sour orange as well as sweet orange scion varieties, expressing genes that would possibly influence the levels of resistance to the Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death disease. The in vitro organogenesis of Citrus species was also studied. In vitro organogenesis experiments were conducted with epicotyl segments obtained from in vitro germinated seedlings of different Citrus species in order to evaluate: organogenic response of three epicotyl regions, in the presence (1,0 mg.L-1) or absence of BAP, in MT medium, and the regeneration using different BAP concentrations (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) added to MT medium. The regeneration of internodal segments of Rangpur lime and sour orange was evaluated in MT medium with different BAP concentrations (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) as well as sour orange regeneration in MT and DBA3 mediums, supplemented with different concentrations of BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) and NAA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). The Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation method of juvenile tissue obtained from in vitro (epicotyls) or green house cultivated plants (internodal segments) was used in this work. The EHA 105 strain was used with the following plasmids: a) pCTV-CP: containing the coat protein gene from CTV; b) pCTV-dsCP: containing inverted repeats of the coat protein gene from CTV interconnected by the Citrus quitinase gene intron; c) pCTVcons: containing an antisense sequence of CTV untranslated region. The gene constructs were built from the pCAMBIA 2201 plasmid, and contained the 35S promoter and the NOS terminator. The nptII selection gene and the GUS reporter gene were also used. The adventitious buds developed were identified as transgenic by GUS histochemical test and PCR, these results were later confirmed by Southern Blot. The transgenic coat protein expression was detected by the serological test PTA-ELISA. The morphogenic response related to the epicotyl region and BAP cytokinin were dependent on the Citrus varieties. The addition of BAP cytokinin to the culture medium showed a greater number of adventitious buds regenerated per explant in both epicotyl and internodal segments of the Citrus varieties studied. The addition of BAP to the culture medium is essential for the regeneration of adventitious buds in sour orange internodal segments. Using the Agrobacterium mediated genetic transformation protocol it was possible to regenerate transgenic plants of different varieties and gene constructs: Rangpur lime containing the coat protein gene of CTV (pCTV-CP) using epicotyl and internodal segments as explant source, and an antisense sequence of CTV untranslated region using internodal segments as explant source; Hamlin sweet orange containing the coat protein gene of CTV in constructions pCTV-CP and pCTV-dsCP, and an antisense sequence of CTV untranslated region using epicotyl segments as explant source.
 
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EvandroSchinor.pdf (1.08 Mbytes)
Data de Publicação
2006-11-27
 
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  • Muniz F R, et al. Genetic transformation of Citrus sinensis with Citrus tristeza virus (CTV)-derived sequences and reaction of transgenic lines to CTV infection. Biologia Plantarum (Praha), 2012, vol. 56, p. 162-166.
  • SCHINOR, Evandro Henrique, et al. In vitro organogensis of Citrus spp. Revista Brasileira de Fruticultura , 2011, vol. 33, p. 526-531.
  • SCHINOR, Evandro Henrique, et al. Organogenese in vitro a partir de diferentes regioes do epicotilo de Citrus sp. Revista Brasileira de Fruticultura , 2006, vol. 28, p. 463-4466.
  • SILVA, Rosely P da, et al. Transformação genética de limoeiro 'Cravo'com sequenias sense e antisense do gene da capa protéica do CTV, interligadas por intron do gene da quitinase dos citros. In XXXIX Congresso Brasileiro de Fitopatologia, Salvador, 2006. Fitopatologia Brasileira.Brasilia : Sociedade Brasileira de Fitopatologia, 2006. Resumo.
  • Souza Amancio Jose de, et al. Reação à infecção pelo Citrus tristeza virus (CTV) em plantas transgênicas de laranja 'Hamlin' transformadas com seqüencias do gnoma do CTV. In Congresso Brasiliero de Fisiologia Vegetal, Gramado/RS, 2007. Congresso Brasiliero de Fisiologia Vegetal - Fotossíntese: a essência da vida. : Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal, 2007. Resumo.
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