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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.11.2008.tde-07082008-124002
Documento
Autor
Nome completo
Lilian Luzia Beloti
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2008
Orientador
Banca examinadora
Camargo, Luis Eduardo Aranha (Presidente)
Bedendo, Ivan Paulo
Oliveira, Julio Cezar Franco de
Título em português
Análise in vitro da expressão de genes de adaptação e de patogenicidade de Leifsonia xyli subsp. xyli em presença de fluido vascular de cana-de-açúcar
Palavras-chave em português
Bactérias fitopatogênicas
Cana-de-açúcar
Expressão gênica
Raquitismo das soqueiras
Reação em cadeia por polimerase.
Resumo em português
O raquitismo das soqueiras da cana-de-açúcar (RSD) é causado pela bactéria Leifsonia xyli subp. xyli (Lxx), sendo uma das principais doenças dessa cultura. O seqüenciamento do genoma da Lxx trouxe novas perspectivas para um melhor entendimento de sua biologia, permitindo a elaboração de suposições sobre seus mecanismos de patogenicidade e adaptação. Estudos preliminares realizados em nosso laboratório mostraram que a adição de fluido vascular de cana-de-açúcar no meio de cultura promove um crescimento mais rápido da bactéria in vitro. Esses resultados levantaram a hipótese de que alguma substância sinalizadora presente no fluido vascular poderia ativar ou reprimir genes da bactéria relacionados ao reconhecimento do hospedeiro. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar in vitro o perfil de expressão gênica de possíveis genes relacionados à patogenicidade e adaptação de Lxx quando cultivada em presença de fluido vascular de cana-de-açúcar em períodos de cinco e vinte minutos. Desta forma, duas variedades de cana-de-açúcar, uma suscetível e outra resistente a Lxx, foram analisadas. O nível transcricional dos genes de interesse foi avaliado por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) pelo sistema SYBR® Green. Os genes hipotéticos de patogenicidade estudados codificam para uma celulase (celA) e uma protease (pat-1), que são homólogos a genes de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Os genes supostamente envolvidos na adaptação ao hospedeiro foram os envolvidos na produção de peroxidase (per) e arginase (arg), relacionados com a resistência ao estresse oxidativo e supressão dos mecanismos de defesa do hospedeiro, respectivamente. No tratamento com fluido vascular da variedade suscetível apenas os genes celA e arg tiveram expressão induzida após cinco minutos de exposição ao fluido. Em presença de fluido vascular da variedade resistente, os genes celA e pat-1 foram positivamente regulados somente no período de cinco minutos, enquanto que o gene arg manteve regulação positiva nos dois períodos observados. O gene per foi reprimido em todos os tratamentos, exceto em fluido vascular da variedade resistente por vinte minutos. No período de vinte minutos, com exceção do gene celA todos os outros genes tiveram a expressão negativa em presença de fluido vascular da variedade suscetível. Estes resultados indicam que substâncias presentes no fluido de cana-de-açúcar atuam como sinais reguladores da expressão gênica em Lxx e esta regulação talvez seja necessária para adaptação e consequentemente colonização no hospedeiro.
Título em inglês
In vitro analysis of the expression of adaptation and pathogenicity genes of Leifsonia xyli subsp. xyli in the presence of sugar cane vascular fluid
Palavras-chave em inglês
Gene expression
Quantitative PCR.
Rattoon stunting disease
Resumo em inglês
Sugarcane ratoon stunting disease (RSD) is a major disease in that crop and is caused by the bacteria Leifsonia xyli subp. xyli (Lxx). Its genome sequencing brought new perspectives for a better understanding of its biology, allowing the elaboration of suppositions concerning its pathogenicity and adaptation mechanisms. Preliminary, studies showed that the addition of 20% vol / vol of sugarcane vascular fluid in the cultivation medium promotes a faster growth of the bacteria in vitro. These results raise the hypothesis that some signalizing molecule/substance in the vascular fluid does activate or repress the bacteria genes related to the host´s recognition.Therefore, the objective of this study was to analyze in vitro the profile of gene expression of possible related genes to pathogenicity and adaptation of Lxx when cultivated in the presence of sugarcane vascular fluid in periods of five and 20 minutes. Two sugarcane varieties where analyzed, one susceptible and one resistant to Lxx. The transcription of the genes of interest was evaluated by quantitative real time PCR (RT-qPCR) by the SYBR® Green system. The hypothetic pathogenicity genes studied encode a cellulase (celA) and a protease (pat-)1, that are homologous to the Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis genes. The genes supposedly involved in the adaptation to the host where the ones involved in the production of peroxidase (per) and arginase (arg), related to the resistance of the oxidative stress and suppression of the host's defense mechanisms, respectivelyWith the Lxx susceptible variety's vascular fluid, only celA and arg genes had their expression induced after a five minutes exposure to the fluid. In presence of the resistant variety's vascular fluid, celA and pat-1 genes where positively regulated only in the exposure period of five minutes, while the arg gene maintained a positive regulation in both observed periods. The per gene was repressed in all treatments, except in the presence of the resistant variety's vascular for 20 minutes. In the 20 minutes period, with the exception of the celA gene, the other genes had negative expression in the presence of vascular fluid of the susceptible variety. These results indicate that substances present in the sugarcane fluid act as regulating signals for the Lxx gene expression and this regulation may be necessary for the adaptation and consequently colonization on the host.
 
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lilian.pdf (1.92 Mbytes)
Data de Publicação
2008-08-11
 
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