Com o objetivo de obtermos isolados de Rickettsia spp. para confirmar as evidências sobre o papel do A. dubitatum e do A. triste na transmissão de riquétsia do GFM no Brasil e Uruguai, respectivamente, realizou-se em áreas endêmicas para febre maculosa nesses dois países, a avaliação da presença de riquétsia em carrapatos da espécie A. dubitatum no município de Pedreira, estado de São Paulo e em carrapatos da espécie A. triste, em uma área suburbana no sudeste do Uruguai, além da tentativa de isolamento em cultivo de células Vero e posterior caracterização molecular de isolados provenientes dessas duas espécies de carrapatos. Foram coletados um total de 841 (367 machos e 474 fêmeas) carrapatos adultos da espécie A. dubitatum e 78 (25 machos e 53 fêmeas) amostras de A. triste, os quais foram submetidos ao teste de hemolinfa. Todas as amostras foram submetidas à extração de DNA e testadas pela técnica da PCR para o gene gltA, presente em todas as espécies de riquétsias. Dos 841 A. dubitatum colhidos, em 153 (18,18%) amostras de hemolinfa foram observados organismos morfologicamente compatíveis com riquétsias, 452 foram negativas (53,74%) e 236 (28,06%) amostras de carrapatos foram inconclusivas. Todas as 78 amostras de carrapatos da espécie A. triste provenientes do Uruguai foram negativas no teste de hemolinfa. Dos 841 A. dubitatum, um total de 378 (44,94%) amostras foram positivas para o gene gltA e, posteriormente, foram testadas para o gene ompA, sendo que nenhuma das amostras foi positiva. Dos 378 A. dubitatum positivos na PCR, o produto amplificado de 93 foi seqüenciado, sendo todos identificados como Rickettsia bellii de acordo com seqüências disponíveis no GenBank. Das 78 amostras de carrapatos da espécie A. triste, provenientes do Uruguai, duas amostras, denominadas de carrapatos #5 e #35, foram positivas na PCR e, submetidas à tentativa de isolamento em células Vero, pela técnica de "shell vial". O estabelecimento do isolado de riquétsia somente foi obtido com sucesso do carrapato #5, sendo este isolado designado de At#5-URG, o qual foi depositado como amostra de referência em nosso laboratório. Amostras de DNA do isolado At#5-URG foram testadas para uma bateria de oligonucleotídeos iniciadores objetivando a amplificação de fragmentos de mais três genes de riquétsias: gltA, ompB e omp, os quais foram, posteriormente seqüenciados e os fragmentos de 1.084, 775 e 491 nucleotídeos dos genes gltA, ompB e ompA, respectivamente, foram obtidos e mostraram 100% de identidade com as seqüências correspondentes disponíveis no GenBank para a cepa Maculatum de Rickettsia parkeri dos EUA.

Owing to the potential role of the tick Amblyomma dubitatum and Amblyomma triste in the transmission of the Spotted Fever Group (SFG) Rickettsia, this study evaluated infection by Rickettsia in ticks collected in Brazil and Uruguay, where rickettsial infection is endemic. A total of 841 (367 males e 474 females) A. dubitatum adult ticks were collected in Pedreira, an area of Brazilian Spotted Fever (BSF) endemicity in the state of São Paulo, and 78 adult ticks (25 males, 53 females) identified as A. triste were collected from vegetation in the suburban area of Toledo Chico, southern Uruguay. At the laboratory, all samples were individually processed by the hemolymph test with Gimenez staining and PCR targeting a fragment of the rickettsial gene gltA, present in all Rickettsia species. From 841 A. dubitatum ticks tested by the hemolymph test, 153 (18.18%) samples were positive, 452 (53.74%) were negative, and 236 (28.06%) were inconclusive. All 78 samples of A. triste ticks from Uruguay were negative by the hemolymph test. All 841 samples of A. dubitatum were submitted to PCR, being 378 (44.94%) positive and afterwards tested by PCR targeting a 150-bp fragment of the ompA (a major outer membrane protein A present only in SFG Rickettsia), being all samples negative. From the 378 PCR-positive samples of A. dubitatum, DNA sequence was determined for 93 samples, being all identified as Rickettsia bellii according to GenBank available sequences. For the A. triste samples, only 2 ticks (1 male, 1 female) yielded expected amplicons by PCR. Rickettsia isolation in cell culture was attempted by using the shell vial technique from these two PCR-positive ticks. Rickettsiae were successfully isolated and established in Vero cell culture from the female tick. This isolate, designated as At#5-URG, has been deposited as a reference strain in the Rickettsial Collection of Faculty of Veterinary Medicine in the University of São Paulo. DNA extracted from infected cells of the third passage was tested by a battery of PCRs that used primer pairs targeting fragments of 3 rickettsial genes: gltA, ompB (a major outer membrane protein B), and ompA. PCR products of expected size were obtained in all reactions and subjected to DNA sequencing. Fragments of 1,084, 775, and 491 bp of the gltA, ompB, and ompA genes, respectively, were obtained and showed 100% identity to the corresponding sequences available in GenBank for the Maculatum strain of Rickettsia parkeri from United States.