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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.10.2006.tde-05032007-150435
Documento
Autor
Nome completo
Felipe Camargo Braga
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2006
Orientador
Banca examinadora
Miglino, Maria Angélica (Presidente)
Ambrosio, Carlos Eduardo
Kfoury Junior, José Roberto
Meirelles, Flavio Vieira
Pereira, Flávia Thomaz Veréchia
Título em português
Apoptose em placenta proveniente de bovinos clonados
Palavras-chave em português
apoptose
BCL-2
bovinos
clonagem animal
placenta
Resumo em português
A produção comercial de bovinos produzidos por transferência nuclear de célula somática permitiu o desenvolvimento de novo modelo no estudo da placenta. A necessidade da cesariana para o nascimento do bezerro favorece a coleta das membranas fetais. Alterações como número total de placentônios, tamanho, formato, árvores vilosas, cordão umbilical, assim como alterações no recém nascido já foram mostradas anteriormente. Gestações produzidas por transferência de núcleo freqüentemente apresentam retenção de placenta. Durante a palpação retal após dois dias da cesariana notou-se placentônios sem diminuição no tamanho e sem alteração na consistência. A observação da ausência de regressão levaram à formulação da hipótese de placentônios provenientes de gestações produzidas por transferência de núcleo apresentam menor freqüência de apoptose quando comparados com placentônios provenientes de gestações produzidas por monta natural. Para testar essa hipótese 15 placentônios provenientes de clones e 3 placentônios provenientes de monta natural foram coletados e congelados em nitrogênio líquido. A extração de RNA foi realizada mediante protocolo Trizol (Invitrogen, Brasil) e a reação de trascriptase reversa feita com Kit Impron II (Promega, Brasil), usando 1µg de RNA total. A quantificação relativa foi desenvolvida no "7500 Real Time PCR System" (Applied Biosystems, EUA), em reação de 25µL contendo 1X "Power SYBR Green PCR Master Mix" (Applied Biosystems, EUA), 1µg de cDNA e 0,6µM de cada primer (BAX, BCL2, e GAPDH). Para a quantificação dos genes ITM2B e PI3K, também se utilizou o gene GAPDH como gene endógeno e reação contendo 1x "Taqman Universal Master Mix" (Applied Biosystems, EUA), 40ng de cDNA, 0,72µM de cada primers (ITM2B, PI3K e GAPDH) e 0,2µM de cada sonda. O programa "LinRegPCR" (RAMAKERS et al., 2003) foi usado para o cálculo da eficiência individual de cada reação e para o cálculo estatístico usou-se o programa "REST2005" (PFAFFL et al., 2002). Os resultados mostraram que o gene BAX possui redução da expressão relativa no grupo transferência de núcleo (P=0,04), enquanto os genes BCL2, ITM2B e PI3K foram iguais entre grupo transferência de núcleo e monta natural. A relação BAX/BCL2 foi maior que 1 em 12 dos indivíduos analisados 12/15 (80%). Nenhuma diferença significativa foi encontrada quando comparadas variáveis como sexo, sobrevivência e peso ao nascimento para todos os genes estudados. A redução da expressão do BAX no grupo transferência de núcleo sugere que a apoptose é menor neste grupo e a relação BAX/BCL2 indica que a redução na taxa de morte celular programada pode ser responsável pela redução na taxa de regressão dos placentônios.
Título em inglês
Apoptosis in bovine cloned placenta
Palavras-chave em inglês
apoptosis
BCL-2
bovine
nuclear transfer
placenta
Resumo em inglês
The study of placenta from somatic cell nuclear transfer pregnancy originated a new model of study after the commercial production of bovine nuclear transfer clones, this technique requires caesarean section, that allows collection of fetal membranes. Alterations as differences in the placentomes total number, size, villous trees, umbilical cord and new born alterations were already described in NT placenta. These nuclear transfer gestations frequently have placental retention and during rectal palpation two days after caesarean section, we observed placentomes with normal characteristics as before section, suggesting an absence of recending. This information about the receding absence lead us to hypothesize that placentomes produced from nuclear transfer pregnancies show lower frequency of apoptosis thus produced from natural. For testing this hypothesis we collected 15 fragments of placentomes from nuclear transfer fetus and 3 of natural mating. The RNA extraction was performed with Trizol (Invitrogen, Brazil) protocol and the reverse transcriptase by Impon II (Promega, Brazil), using 1µg of total RNA. We performed the real time relative quantification technique in the "7500 SDS System" (Applied Biosystems, USA) to investigate the mRNA expression of BAX, BCL2 as apoptosis genes and GAPDH as endogenous gene, with concentrations of 1X Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), 1µg of cDNA and 0.6µM of each primer (BAX, BCL2, and GAPDH) in 25µL of total reaction. The ITM2b and PI3K as apoptosis genes and GAPDH as endogenous gene with concentrations of 1x Taqman Universal Master Mix (Applied Biosystems, USA), 40ng of cDNA, 0.72µM of primers (ITM2B, PI3K and GAPDH) and 0.2µM of each probe. The "LinRegPCR" software (RAMAKERS et al., 2003) was used for individual efficiency calculation and the "REST2005" (PFAFFL et all, 2002) software for statistical analysis, using the standard efficiency. The results show that BAX gene is down regulated in the nuclear transfer group (P=0.04), while the BCL2, ITM2B and PI3K are equal in nuclear transfer and natural mating groups. The relation BAX/BCL2 was greater than 1 in 12 nuclear transfer samples 12/15 (80%). No significant difference was found when evaluated variables such as survival, calv sex, birth weight for all studied genes. The lower expression of BAX gene in nuclear transfer groups suggests that apoptosis is lower in this group and the relation BAX/BCL2 is indicative that a lower rate of apoptosis may be responsible for the lower rate of placentome receding.
 
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Data de Publicação
2007-03-08
 
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