O desequilíbrio entre a capacidade antioxidante e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), também conhecido como estresse oxidativo (EO), pode ser extremamente prejudicial aos espermatozoides dos mamíferos. Essa célula é altamente susceptível ao EO devido ao seu citoplasma reduzido e consequente limitação na reserva antioxidante citoplasmática. Além disso, os espermatozoides exibem em sua membrana uma grande quantidade de ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs), facilmente oxidadas e vulneráveis a peroxidação lipídica. Por outro lado, esses ácidos graxos, conferem fluidez a membrana plasmática, desempenhando um importante papel nos processos de fertilização além de proteger os espermatozoides durante a criopreservação. Com base nessas afirmações, adicionar ácidos graxos poliinsaturados na composição do diluente de sêmen canino para a criopreservação seria uma alternativa interessante. No entanto, parece plausível associar a esse diluente com PUFA um tratamento antioxidante para prevenir a exacerbada peroxidação lipídica. Portanto, o objetivo deste estudo foi associar o tratamento antioxidante com suplementação de PUFA, o ácido docosahexaenoico (DHA), ao diluidor para a criopreservação de sêmen canino. Para isso, foram desenvolvidos três experimentos visando a melhora da qualidade do sêmen criopreservado, utilizando-se em cada um deles, o sêmen de oito cães saudáveis e sexualmente maduros e avaliações das amostras para motilidade, membrana plasmática e integridade acrossômica, integridade do DNA, atividade e função mitocondrial e susceptibilidade da peroxidação lipídica. No primeiro estudo avaliou-se a susceptibilidade espermática a diferentes desafios de indução oxidativa (ânion superóxido [O₂^-], peróxido de hidrogênio [H₂O₂], radical hidroxil [OH^-] e malondialdeído [MDA]) na presença ou ausência de plasma seminal (PS). Sêmen com PS teve função mitocondrial preservada contra EROs. No entanto, na ausência de PS, H₂O₂ reduziu o potencial da membrana mitocondrial. Além do mais, independentemente do PS, H₂O₂ foi deletério para a cinética espermática e para as membranas plasmática/acrossomal, e OH^- reduziu a atividade mitocondrial e aumentou a fragmentação do DNA. No entanto, amostras com PS foram mais resistentes para a peroxidação lipídica. O segundo estudo foi feito testando o DHA em três concentrações diferentes, para isso foi dividido em quatro grupos: controle, 1µM DHA, 5µM DHA e 10µM DHA. Foram adicionados ao diluidor de sêmen, em seguida congelados, descongelados e analisados. Foram constatadas diferenças significativas entre o grupo controle e 1µM DHA, com este último apresentando menores valores para motilidade progressiva e espermatozoides rápidos e que o grupo 5µM DHA obteve menores valores de espermatozoides para espermatozoides estáticos comparando com todos os demais grupos. Desta forma, para o terceiro estudo selecionamos a concentração de 5µM DHA para associar com os antioxidantes catalase e vitamina E no diluidor (que combatem o radical OH^- e o H₂O₂, respectivamente), baseando-se no primeiro e no segundo estudo. Os antioxidantes foram adicionados ao diluidor de sêmen e divididos em quatro grupos (todos contendo 5µM DHA): controle, vitamina E (0,6mM), catalase (300U/mL) e vitamina E (0,6mM) mais catalase (300U/mL). As amostras foram congelados, descongelados e avaliadas. Os resultados mostraram que o diluidor de sêmen canino contendo 5µM DHA mais vitamina E teve efeitos benéficos nas características cinéticas espermáticas, como velocidade média de percurso (VAP), velocidade linear (VSL), motilidade, motilidade progressiva e espermatozoides rápidos; enquanto 5µM DHA no diluidor, mais catalase não mostrou o efeito benéfico potencializado esperado, indicando que esse antioxidante parece ter toxicidade para o espermatozoide na concentração utilizada em nosso experimento. Finalmente, diluidor com 5µM DHA suplementado com vitamina E mais catalase, não aumentou a qualidade da cinética e estrutura espermáticas, mas melhorou a resistência ao estresse oxidativo. Concluímos que a suplementação do meio diluidor com DHA em associação com a vitamina E melhorou a qualidade espermática pósdescongelamento em sêmen criopreservado de cães.

The imbalance between the antioxidant capacity and the production of reactive oxygen species (ROS), also known as oxidative stress (EO), can be extremely harmful to mammalian sperm. This cell is highly susceptible to EO due to its reduced cytoplasm and consequent limitation on the enzymatic antioxidant reserve. In addition, sperm exhibit a large amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), which confer fluidity to the plasma membrane, playing an important role in the fertilization processes. Also, PUFAs are known to protect the sperm during the cryopreservation process. However, PUFAs are easily oxidized and vulnerable to lipid peroxidation. Based on these statements, adding polyunsaturated fatty acids in the canine semen diluent composition to cryopreservation would be an interesting therapy. However, it seems plausible to associate this diluent containing PUFA with an antioxidant treatment to prevent exacerbated lipid peroxidation. Therefore, the objective of this study was to associate the antioxidant treatment with docosahexaenoic acid (DHA) supplementation to the cryopreservation extender of canine semen. Towards this aim, three experiments were developed aiming to improve the quality of cryopreserved semen. For all the experiments, semen samples of eight healthy and sexually mature dogs were collected. Post-thaw semen evaluations consisted of motility, plasma and acrosome membrane integrity, DNA status, mitochondrial activity and function, and susceptibility of lipid peroxidation. In the first study, we aimed to assess which ROS is the most deleterious for canine semen in the absence of seminal plasma (condition required for the cryopreservation). This was performed in order to define the ideal antioxidant for semen cryopreservation. Therefore, semen samples were incubated with different oxidative induction challenges (superoxide anion [O₂ ^-], hydrogen peroxide [H ₂ O ₂], hydroxyl radical [OH^-] and malondialdehyde [MDA]) in the presence or absence of seminal plasma (PS). Semen with PS had a mitochondrial function preserved against ROS. However, in the absence of PS, H ₂ O ₂ reduced the potential of the mitochondrial membrane. Moreover, regardless of the PS, H ₂ O ₂ was deleterious for the sperm kinetics and for the plasmatic/acrossomal membranes, and OH^- reduced mitochondrial activity and increased DNA fragmentation. However, PS samples were more resistant to lipid peroxidation. The second study was performed by testing DHA in three different concentrations. Ejaculates were divided into four groups: control, 1µM, 5µM and 10µM DHA added to the semen extender. Samples were cryopreserved, thawed and analyzed. Significant differences were found between the control group and 1µM, with the latter presenting lower values for progressive motility and rapid spermatozoa and the 5µM group showed lower values of static spermatozoa compared to all the other gorups. Therefore, in the third experiment we selected the concentration of 5µM DHA to associate with the antioxidants catalase and vitamin E in the extender (specific for OH^- and the H ₂ O ₂, respectively), based on the first and second studies. Antioxidants were added to the semen extender and divided into four groups (all containing 5µM DHA): control, vitamin E (0,6mM), catalase (300u/ML) and vitamin E (0,6mM) plus catalase (300u/ML). Samples were cryopreserved, thawed and evaluated. The results showed that canine extender containing 5µM of DHA plus vitamin E had beneficial effects on the sperm kinetic characteristics, such as mean route velocity (VAP), linear velocity (VSL), motility, progressive motility and percentage of rapid sperm, while 5µM of DHA in the diluent, plus catalase did not show the expeted potentiated benefical effect, indicating that this antioxidant appears to have sperm toxicity at the concentration used in our experiment. On the other hand, 5µM of DHA suplemented with vitamin E plus catalase, did not increase the quality of the kinetics and spermatic structure, but improved the resistance to oxidative stress. We conclued that the suplementation of the extender canine with DHA in association with vitamin E improved the post-thawing sperm quality in cryopreserved semen of dogs.