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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.10.2007.tde-21052007-103859
Documento
Autor
Nome completo
Rodrigo Del Rio do Valle
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2007
Orientador
Banca examinadora
Guimarães, Marcelo Alcindo de Barros Vaz (Presidente)
Assumpção, Mayra Elena Ortiz D'Avila
Barnabe, Valquiria Hyppólito
Gomes, Mauricio Talebi
Pissinatti, Alcides
Título em português
Colheita, análise e criopreservação de sêmen de uma espécie modelo de primata neotropical, Sagui-de-Tufo-Branco (Callithrix jacchus)
Palavras-chave em português
Callithrix jacchus
Criopreservação animal
Diaminobenzidina
DNA
Sêmen animal
Resumo em português
A espécie Callithrix jacchus pode ser utilizada como modelo experimental para outras espécies de primatas neotropicais, principalmente Callithriquídeos. Colheu-se sêmen desta espécie com os objetivos de otimizar a colheita de sêmen por vibro estimulação peniana, validar técnicas de avaliação espermática que possam ser utilizadas a campo, comparar as características seminais de indivíduos de duas colônias (Brasil e Alemanha), testar diferentes protocolos de congelação espermática e avaliar a atividade citoquímica mitocondrial (DAB) e a fragmentação de DNA de espermatozóides congelados. As técnicas de coloração para avaliação espermática utilizadas foram: eosina-nigrosina, coloração dupla trypan-blue giemsa, coloração simples para acrossoma, FITC-PSA, SpermOscan®, Spermac®, coloração com 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e ensaio Cometa alcalino. A congelação foi realizada com 100 µL de sêmen com meio TEST-Gema de ovo clarificado com glicerol 4% em palhetas 0,25 mL, e os protocolos de congelação testados foram: 1) fase de equilíbrio com curva de resfriamento (25°C-4°C) em 2 horas, 10 minutos no vapor de nitrogênio e finalmente imersão em nitrogênio líquido; 2) como Protocolo 1, mas sem fase de equilíbrio/resfriamento; e 3) diretamente no nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas em água a 37°C por 5-10 segundos. A técnica de colheita resultou em 83,33% dos procedimentos com ejaculação. A coloração simples para acrossomo foi eficiente e pôde ser validada para utilização a campo. Não houve diferença significante (p<0,05) nas características seminais avaliadas entre as colônias do Brasil e da Alemanha. As análises pós-descongelação demonstraram queda nas variáveis motilidade e integridade da membrana plasmática com discreta superioridade no Protocolo 1, não houve diferença significante (p<0,05) entre os protocolos para a atividade citoquímica mitocondrial e o Protocolo 2 apresentou a menor taxa de fragmentação de DNA.
Título em inglês
Collection, analysis and cryopreservation of semen from a model species, the common marmoset (Callithrix jacchus)
Palavras-chave em inglês
Callithrix jacchus
Animal Semen
Cryopreservation
Diaminobenzidine
DNA
Semen
Resumo em inglês
The Callithrix jacchus can be used as a model species for other Neotropical primates species, mainly Callithriquids, for reproductive studies. Semen samples were collected with the following objectives: to improve the penile vibrostimulation technique, validate sperm evaluation techniques for field work, analyse the semen characteristics from animals at 2 colonies (Brazil and Germany), use 3 different freezing protocols in common marmosets sperms, evaluate a cytochemical technique for mitochondrial activity demonstration and evaluate DNA damage in frozen-thawed sperms. The staining techniques used in this work were: Eosin-nigrosin, Trypan-blue Giemsa, simple staining for acrosome, FITC-PSA, SpermOscan®, Spermac®, demonstration of cytochrome c oxidase activity in situ by the oxidation of 3,3'-diaminobenzidina (DAB) and the Comet assay. Freezing was done in 100 µL semen with TESt-Yolk clarified medium plus 4% glycerol using 0.25 mL straws. The freezing protocols tested were: 1) straws at equilibrium phase with a 25°C to 4°C curve in 2 hours, 10 minutes at nitrogen vapour and finally into liquid nitrogen; 2) same as Protocol 1 without the equilibrium phase; and 3) straws directly into liquid nitrogen. All attempts resulted in 83,33% ejaculates. The simple staining technique for acrosome was validated and resulted in an obvious differentiation of the intact acrosome. Semen characteristics evaluation showed no difference between the 2 colonies. Post-thaw evaluation showed all protocols had negative effects on motility and plasmatic membrane integrity with a slightly superiority on Protocol 1. There was no difference between protocols in the mitochondrial activity demonstration and Protocol 2 presented the lowest DNA damage.
 
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Data de Publicação
2007-05-29
 
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